氨基酸铜配合物的合成、表征及对质粒DNA的切割

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1、综合化学实验——配位化学和生物无机化学部分切割DNA的金属配合物指导教师：毛宗万黄华珍cesmzw@mail.sysu.edu.cnhuanghuazhen@mail.sysu.edu.cn中山大学化学与化学工程学院2009年10月http://ce.sysu.edu.cn/ChemEdu/Echemi/comlab/index.htm实验3功能型甘氨酸铜配合物的合成和表征模板合成IR光谱表征自由基的UV光谱检测实验4功能型甘氨酸铜配合物对质粒DNA的切割琼脂糖凝胶电泳凝胶成像总学时：15学时地点

2、：丰盛堂218室实验内容Ⅰ超螺旋DNAⅡ缺刻型DNAⅢ线型DNA自由基机理自由基进攻糖环或碱基，导致氧化破坏酯水解机理亲核试剂进攻磷原子，发生亲核取代反应酯水解机理优于自由基机理DNA结构及其断裂方式配合物与未受损的DNA表面结合并诱导其断裂进一步在新的断裂处结合断裂反应互补链的断裂DNA的自由基断裂实验背景——模拟博莱霉素在天然物质中，由5个氨基酸、2个六碳糖和1个氨基侧链构成的博来霉素（bleomycin）可导致DNA链的断裂,从而作为一族广谱抗菌抗肿瘤药物。导致DNA链的断裂原因是由于博来霉

3、素分子的一部分是铁或铜的配合物，这类配合物能够产生导致DNA链断裂的自由基。CuP-3A的配位结构示意图博莱霉素的活性中心Pamatong,F.V.;Detmer.C.A.,III;Bocarsly,J.R.;J.Am.Chem.Soc.,1996,118,5339.Detmer.C.A.,III;Pamatong,F.V.;Bocarsly,J.R.;Inorg.Chem.,1996,21,6292.博莱霉素的模型化合物Cu2++e-=Cu+Cu++H2O2=Cu2++OH-+OH氨基酸铜化合

4、物的合成路线模板反应的化学机理化合物1的红外光谱(COO-)(COO-)(NO2)(NO2)化合物2的红外光谱(COO-)(COO-)(NH2)氢氧自由基的形成和UV光谱检测由于罗丹明B可与HO·迅速反应，并在553nm有强吸收，因此我们可以利用此反应采用分光光度法检验HO·的生成。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶

5、解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等凝胶浓度选择——琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2电泳缓冲液常用三种缓冲液Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)、Tris-磷酸(TPE)TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉

6、淀TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解核酸电泳的指示剂指示剂：溴酚兰、二甲苯青溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率2Kb1.6Kb核酸电泳的染色剂——溴化乙锭一种荧光染料，EB分子可嵌入

7、核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察ethidiumbromide，EB电泳实验装置电泳仪（普通）电泳槽（水平平板）灌胶模具等电泳实验方法洗净电泳槽，架好梳子配制琼脂糖凝胶及倒胶上样与通电结果观察配制琼脂糖凝胶及倒胶0.5×

8、TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化，冷却至60℃(需要时可加入EB)，倒入电泳槽中，待凝固。向电泳槽中倒入0.5×TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子（如样品孔内有气泡，应除去）上样与通电在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为1—5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）根据指示剂泳动的位置，判断