克雷伯氏杆菌噬菌体的生物学特性及其抗性菌株的选育

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1、硕士学位论文克雷伯氏杆菌噬菌体的生物学特性及其抗性菌株的选育BiologicalcharacterizationofabacteriophageofKlebsieUapneumoniaandscreeningofresistantstrainstothephage学号：21018023完成日期：2Q!墨生鱼旦大连理工大学DalianUniversityofTechnology大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，

2、也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：疆丝&妊萄益盏篮筮幽丝雠趔盈丝盏凼幽作者签名：盏盏日期：塑丝年—上月j乙日大连理工大学硕士学位论文摘要克雷伯氏杆菌是微生物法发酵生产l，3．丙二醇的重要生产菌种，生产过程中若发生噬菌体感染，将影响细胞生长和代谢，给生产造成巨大的经济损失。目前微生物发酵工业生产中感染噬菌体的报道主要集中在乳制品工业以及少数的大宗化学品产业，1，3．丙二醇发酵生产过程中噬茵体的信息比较有限，国内尚处空白。鉴于上述情况，本

3、论文分离出造成发酵异常的克雷伯氏杆菌的噬菌体，考察其生物学特性及其对发酵代谢的影响，对防治噬菌体污染进行了初步的探索，并筛选了抗噬菌体的菌株。首先，对克雷伯氏杆菌的噬菌体进行了鉴定、分离和分类。以丝裂霉素C诱导法鉴定产生异常发酵的生产菌株溶源性噬菌体，采用敏感指示菌法及Adams双层平板法从引起发酵异常的克雷伯氏杆菌中分离纯化出一株溶源性噬菌体。通过氯仿敏感性实验测定显示，该噬菌体对氯仿不敏感，从而表明该噬菌体无包膜，其衣壳内不含脂类物质。用磷钨酸负染法透射电镜观察，从形态学上进行分类，属于有尾噬菌体目，长尾噬菌体科。手工法提取噬菌体核酸，限制性内切酶EcoRI和觑刀dII

4、I酶切后进行琼脂糖凝胶电泳分析，表明该噬菌体的核酸为dsDNA。根据酶切图谱估算的噬菌体基因组大小约为42kb。其次，测定了噬茵体的生物学特性，其最佳感染复数为1；一步生长曲线显示，噬菌体的潜伏期与裂解期均为50min，裂解量为343个。还考察了温度、pH、紫外线等理化因素对噬茵体活性的影响。该噬菌体对温度比较敏感，其最适温度为37℃，经70℃处理30min即完全失活。其存活的pH范围较宽，对酸碱均有一定的抗性，在pH7．8范围内效价最高，较耐碱性，在偏酸性条件下(pH<4)效价降低速率较快。该噬菌体对紫外线照射非常敏感，照射3min活性即下降90％以上，照射时间达12mi

5、n之后基本完全失活。再次，考察了噬菌体对克雷伯氏杆菌生长和发酵代谢的影响。结果显示，与正常克雷伯氏杆菌相比，感染噬菌体的宿主细胞生长停滞期约8h，最高菌体浓度下降了33％。比较两种情况下的主要代谢产物生成情况，其主产物1，3．丙二醇产量下降38％，代谢流偏向了乳酸等有机酸途径。为探索针对噬菌体污染的防治措施，考察了Ca2+、三种不同浓度的表面活性剂以及不同浓度的氨苄青霉素对降低噬茵体影响菌体生长的作用，结果显示所考察的三种方法条件对噬菌体均无有效的抑制作用。最后，筛选抗性菌株。通过高浓度噬菌体侵染条件下的自发突变经初筛、复筛得到一株抗性菌株。发酵验证显示，该菌株菌体生长未出

6、现停滞现象，表现出了一定的抗性。但代谢流仍然偏向乳酸等有机酸途径，导致1，3．丙二醇产量偏低。进一步采用等离子体克雷伯氏杆菌噬菌体生物学特性研究及抗性菌株的选育与Li+进行复合诱变的方法对抗性菌株进行改造，使得其产量增加了13．1％，证明进一步筛选到优良抗噬菌体高产菌株是具有可行性的。关键词：克雷伯氏杆菌；噬菌体；生物学特性；l，3．丙二醇发酵；抗性菌株大连理工大学硕士学位论文BiologicalcharacterizationofabacteriophageofKlebsiellapneumoniaandscreeningofresistantstrainstotheph

7、ageAbstractKlebsiellapneumoniaisanimportantspeciesproducing1,3一propanediolfromglycer01．However，phageinfectioncouldseriouslyinfluencecellgrowthandmetabolism，whichaffectedtheproductionandthequalityofproductsandcausedgreateconomiclossestothefermentationindustry．T