深海热液区微生物的筛选鉴定及对深海环境的响应机制

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1、山东师范大学硕士学位论文深海热液区微生物的筛选鉴定及对深海环境的响应机制中文摘要深海热液区是大洋底部的一个特殊区域，具有高温，高压，重金属胁迫等极端特点。深海热液区也是一个巨大的生态产能系统，它很少依赖光能，主要通过微生物转化形成化学能。由于热液区急剧变化的物理和化学梯度，微生物的多样性极为丰富，包括极端嗜热、嗜冷，嗜酸、嗜碱，嗜压和睹盐菌等。它向人类展示了一个巨大的未知生物圈，正在改变人类关于地球微生物生存环境和生命起源的认识。为适应极端的生活环境，微生物采用特殊的能量机制，rTCA循环就是其中的一种。与存在于植物、藻类和一些菌类中的卡尔文循环不同，该反应氧化4分子的C02，合成1分子的

2、草酰乙酸。有多种酶类涉及该循环，其中ATP柠檬酸裂解酶(ACL)、Q．酮戊二酸：硫铁氧化还原蛋白(OOR)和丙酮酸：硫铁氧化还原蛋白(POR)这3种酶是该循环的关键酶。本研究运用分子生物学方法对印度洋深海热液区可培养细菌进行了分子鉴定和系统发育分析。采用MMJHS寡营养培养基，从印度洋深海热液区沉积物和热液硫化物中分离获得16株细菌，通过16SrDNA序列比对和生理生化分析，对它们进行了鉴定并构建了系统发育树。结果表明，12株细菌属于Y．变型菌纲(Y．proteobacteria)，其中6株属于盐单胞菌属(Halomo，las)，4株属于嗜冷杆菌属(Psychrobacter)，2株属于食

3、碱菌属(Alcanivorax)；其余4株属于芽孢杆菌属(Bacillus)，其中l株为地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenifotrois)。分离获得的16株细菌均呈革兰氏阴性；H2S反应，吲哚测定反应，M．R和V．P均呈阴性。研究为深入认识和开发利用深海热液区微生物资源奠定了基础。分子生物学研究表明，深海热液区存在大量以自由生活和共生体两种形式生存的￡．变形细菌，它们在区内占有主导地位。本文首次对深海热液区一株e．变形细菌嗜热硫氧化菌CaminibacterprofundusstrainDSMZ15016的能量代谢机制进行了研究。运用PCR扩增技术，利用引物从基因组DNA中成功扩

4、增得到了rTCA循环的关键酶基因aclB，porA和oorA(分别编码ACL13亚基、PORQ亚基和OORQ亚基)，但是没有扩增到卡尔文循环关键酶1，5．二磷酸核酮糖酶(RubisCO)的两种形式酶基因c66己和cbbM；同时，运用相同方法从RNA转录得到的cDNA中扩增到了aclB和oorA酶基因，而没有得到cbbL和cbbM：采用分光光度方法，检测到了ACL、POR和OOR酶的活性，分别从DNA、RNA和细胞水平证明了CaminibacterprofundusstrainDSMZ15016采用rTCA循环进行碳的固定。酶学分析表明，45℃培养时ATP依赖的柠檬酸裂解酶(ACL)的活性最

5、佳，细菌培养至第6天时，该酶的表达量达到最高值；40℃和45℃培养时，OOR山东师范大学硕士学位论文和POR的活性最佳，均在第4天时表达量达到最高值。通过设计引物，运用SYBRGreenI实时定量技术，检测了环境因子对RNA水平aclB和oorA表达的影响。定量结果表明，温度对关键酶基因表达影响较小，40℃培养条件下，aclB相对表达量最高，在第二天达到表达最高值，oorA在45"C培养条件时表达量最高，同样在第二天时达到最高值；aclB和oorA均在环境盐度30∥L和环境pH7．O时表达量最高；actB在厌氧培养时表达量最高，而oorA在3％含氧表达量最高；但是此后进行氧气胁迫时后，ac

6、lB与oorA表达发生变化，且均在厌氧条件下表达较好。本研究初步揭示了深海热液区e．变形细菌能量代谢相关酶对环境条件变化的响应，对于深入了解深海热液区e．变形细菌能量代谢机制以及探讨rTCA途径在全球碳循环中的作用具有重要意义。关键词：深海热液区，可培养，16SrDNA，多样性，rTCA循环，￡．变形细菌，实时定量PCR中图分类号：Q1782山东师范大学硕士学位论文ScreeningandIdentificationofbacteriafromhydrothermalventsandtheirresponsivemechanismtothedeep．．seaenvironmentABSTR

7、ACTDeep-seahydrothermalventsarespecialregionsinthebosomofoceanswhicharecharacterizedbytheirextremeenvironmentalconditions，includinghighpressure，highgradientoftemperaturesandhighconcentrationsintoxicelements(sulfi