云南烟草病毒检测及防治研究

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1、浙江大学博士学位论文云南烟草病毒检测及防治研究姓名：刘勇申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：周雪平20060901浙江大学博士学位论文摘要烟草病毒病是危害烟叶生产最重要的病害之一，危害烟草的病毒种类多达30多种，花叶型病毒病田问常见，曲叶型病毒病的危害呈上升趋势。为了弄清云南烟草病毒病的种类，对云南省烟草花叶型和曲叶型病毒病样品进行了血清学和分子检测，并对烟草病毒病控制进行了研究。采用抗原直接包被法和双抗体夹心法对采自云南烟草花叶病样本进行了病毒种类检测，并利用三抗体夹心法对黄瓜花叶病毒(CucumbermosaicVirUS,C埘)的亚组类型进行了鉴定：在云南采集的5

2、20个病毒病样本中，烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,T^I＼，)、ClI、，和马铃薯Y病毒(Potatovirus只PW)总检出率分别为71．74％、55．01％和6．35％，云南、湖南和福建64个cM＼『阳性样品中，属亚组I的样品为57个，占89．1％，属亚组II样品为lO个，占15．6％。采用烟草曲茎病毒(TobaccocurlyshootVirUS,TbCSv)、云南烟草曲叶病毒(Tobacco]eafctLr]Yunnanvirus,TbLcYNV)，中国番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcur]Chinavirus,TYLCCNV)

3、的特异引物，对云南烟草曲叶病样本的病原进行了PCR检测；采用粉虱传双生病毒PA和PB通用引物，对代表性样品进行了扩增、克隆测序和序列比对。检测表明云南烟草曲叶病是由TbCSV、TbLCYNV和TYLCCNV三种病毒引起的。109个烟草曲叶症状的样本中，TbCSV总检出率为41．3％、TbLCYNV总检出率为16．5％、TYLCCNV总检出率为53．2％。其中两种或三种病毒复合侵染的检出率为8．2％。500bp序列比较表明，这些病毒分离物之间的相似性为77％～100％。依据500bp序列构建的同源关系树上，所有TYLCCNV的分离物因地理隔离聚为两大类，～类为保山分离物，相互间核

4、苷酸序列相似性为93％，另一类为文山和红河分离物，相互间核苷酸序列相似性为95％，两类之间核苷酸序列相似性为89％。对其中一个分离物Y264DNA-A的全序列测定表明，Y264DNA—A全长2741个核苷酸(nts)。具有典型的begomoviruses结构，共编码6个开放读码框(0RFs)。DNA-A全长与中国番茄黄化曲叶病毒分离物YIO的相似性最高，为91．3％，各ORFs编码的氨基酸序列与TYLCCNV的相似性最高。因此，Y264为TYLCCNV的一个分离物。采用三抗体夹心法对云南烟草漂浮苗样本进行了病毒种类检测，在云南采集的1400多个烟草漂浮苗样本中，TMv的检出率占

5、总阳性样本数的95％以上；clIv和马铃薯Y属病毒(包括PVY和TEv)的检出率占总阳性样本数的5％以下。在漂浮苗移栽后至团棵期，在发病率高(20％以上)的田块中采集的480个花叶病样本中，浙江大学博士学位论文不同田块Tw检出率48．1％～100％，而CMV和马铃薯Y属病毒(包括PrY和TEV)检出率0％～12．2％。表明危害云南烟草漂浮苗的主要病毒种类为TMv。采用半叶法测定了9种药剂对烟草病叶汁液中TMV的钝化效果，采用叶面喷雾法测定了药剂对烟草的药害浓度与药害症状。室温下一定浓度的药剂与1：10000的TMV病叶汁液等体积混合3min时，30％有效氯漂白粉10倍液、98％

6、磷酸三钠·12H。010倍液、7％有效氯次氯酸钠150倍液、美国消毒剂125倍液和75％酒精TMV的抑制率可达100％；10％二氧化氯200倍液和40％育宝150倍液与TMv混合30min时对TMv的抑制率可达100％和96．30％；0．6％菌毒净19．5倍液、3．95％病毒必克800液和24％毒消800倍液与TlIv混合30min时对TM、，的抑制率低于80％。除0．6％菌毒净较安全外，供试消毒剂在常用浓度下接触烟草叶片，产生较严重药害，症状因消毒剂种类不同，主要为褪绿斑点、坏死斑点和畸形。试验了在漂浮育苗池中使用消毒剂对Tw的钝化效果和烟苗出苗和生长的影响。枯斑寄主测定表明

7、：与nfv病叶汁液2万倍稀释液接触12hr，对TMV的抑制率高于80％的消毒剂及浓度为：30％有效氯漂白粉15mg／L和150mg／L；7％有效氯次氯酸钠2以几和20岖／L；美国消毒剂5I_zl／L和50m几。漂浮池水中加入低浓度消毒剂，出苗率和成苗率与对照差异不显著，但对烟苗后期长势的影响因消毒剂种类而有差异。对烟苗长势有促进作用的消毒剂有：磷酸三钠15mg／L～300mg／L、硫酸铜50mg／L～100mg／L、高锰酸钾10mg／L～40mg／L和24％毒消10蛆／L。对烟苗长势低浓度无