基因组DNA羟甲基化电致化学发光生物传感研究

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1、分类号：O657学校代码：10697密级：公开学号：201520692硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION基因组DNA羟甲基化电致化学发光生物传感研究学科名称：分析化学作者:王欢指导老师：李延教授西北大学学位评定委员会二○一八年ElectrogeneratedchemiluminescencebiosensingmethodfortheinvestigationofgenomicDNAhydroxymethylationAthesissubmittedtoNorthwestUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementsforthe

2、degreeofMasterinAnalyticalChemistryByHuanWangSupervisor:YanLiProfessorJune2018摘要5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine,5-hmC）是继5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5-mC）之后发现的第六种碱基，由TET（ten-eleventranslocation）蛋白家族酶催化氧化5-mC生成，已发现在多种哺乳动物组织和细胞中有着丰富的表达。与5-mC相比，5-hmC含量更低，但是其在许多生物过程中发挥着独特的生物学功能。更重要的是，越来越多的研究表明，5-hmC水平在各种癌细

3、胞中显著降低，这意味着它可能成为癌症早期诊断的生物标志物。因此，建立可靠、选择性高且简便的基因组中5-羟甲基胞嘧啶双链DNA（5-hmC-dsDNA）检测方法至关重要。电致化学发光（Electrogeneratedchemiluminescence,ECL）分析技术因具有电化学电势可控和化学发光灵敏度高的双重优势，已广泛应用于生物分析，免疫分析，食品安全和环境监测等领域。基于此，本论文以5-hmC-dsDNA为研究目标，从丰富双链DNA的固定化方式角度入手，建立了两种高选择性和高灵敏的检测基因组中5-hmC-dsDNA的ECL生物传感方法。全文共分为三章，主要内容如下：第一章，首先介绍了电化学

4、发光的基本原理和应用，其次综述了DNA的组成、结构和电化学发光DNA生物传感器的基本原理，最后总结了DNA羟甲基化及其研究进展，并阐述了本论文的研究内容及意义。第二章，通过使用固定探针和钌复合物标记的报告探针作为ECL探针，结合高钌酸钾选择性氧化5-hmC-dsDNA，建立了一种检测5-hmC-dsDNA的ECL生物传感新方法。结果表明，5-hmC-dsDNA含量在0.0090％~0.5761％范围内时，电化学发光强度与5-hmC-dsDNA含量呈良好的线性关系（R=0.9973），检出限为0.0036%（S/N=3）。该方法可用于小鼠不同组织中5-hmC-dsDNA的检测，并发现不同小鼠组织

5、中5-hmC-dsDNA含量差异显著：脑组织中含量最高，脾脏组织中最低，表明所建立的传感方法可用于生物组织中5-hmC-dsDNA的检测。第三章，基于聚腺嘌呤-金的相互作用电化学发光高灵敏检测基因组5-hmC-dsDNA。首先通过使用DNA甲基转移酶（M.HhaI）对DNA序列中5-hmC的羟基进行化学修饰，在M.HhaI存在的情况下，5-hmC-dsDNA经巯基乙胺处理后可转化成氨基衍生的5-hmC-dsDNA。然后将一条含有聚腺嘌呤（polyA）的DNA作为固定探针，通过聚腺嘌呤-金的特异性吸附作用将5-hmC-dsDNA固定在电极表面。最后，利用生物素-亲和I素的高亲和作用使得亲和素修饰

6、的钌复合物结合到固定探针上，根据ECL强度与5-hmC-dsDNA含量之间的关系，实现了对5-hmC-dsDNA的高灵敏检测。该方法对5-hmC-dsDNA的检出限达0.0003％（S/N=3）。关键词：电致化学发光，生物传感器，基因组DNA，5-羟甲基胞嘧啶双链DNA，聚腺嘌呤IIABSTRACTTherecentlyre-discovered5-hydroxymethylcytosine(5-hmC)hasbeenrecognizedasthesixthbaseafter5-methylcytosine(5-mC),whichcanbeformedunderthecatalysiseffe

7、ctofteneleventranslocation(TET)proteinsto5-mC.5-hmCwasabundantinmanymammaliantissuesandcells.Althoughthecontentof5-hmCismuchlowerthan5-mC,5-hmCplayskeyroles.Moreover,moreandmorestudieshaveshownthatthe