基于微流控芯片的无细胞蛋白合成与纯化研究

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1、学校代号10532学号S151101030分类号密级公开硕士学位论文基于微流控芯片的无细胞蛋白合成与纯化研究学位申请人姓名肖晓培养单位化学化工学院导师姓名及职称羊小海教授王柯敏教授学科专业分析化学研究方向纳米尺度及分子水平上的生化分析论文提交日期2018年05月22日I基于微流控芯片的无细胞蛋白合成与纯化研究学校代号：10532学号：S151101030密级：湖南大学硕士学位论文基于微流控芯片的无细胞蛋白合成与纯化研究学位申请人姓名：肖晓导师姓名及职称：羊小海教授王柯敏教授培养单位：化学化工学院专业名称：分析化学论文提交日期：2

2、018年05月22日论文答辩日期：2018年05月28日答辩委员会主席：吴海龙教授Cell-freeProteinSynthesisandPurificationBasedonMicrofluidicChipsbyXIAOXiaoB.S.(ShaanxiNormalUniversity)2015AthesissubmittedinpartialsatisfactionoftherequirementsforthedegreeofMasterofscienceinAnalyticalchemistryintheGraduatesc

3、hoolofHunanUniversitySupervisorsProfessorYangXiaohaiProfessorWangKeminMay,2018III硕士学位论文摘要重组蛋白药物具有特异性高、生物相容性好等优点，其安全性显著高于小分子药物，越来越受到制药企业的重视。然而，由于蛋白对温度敏感，所以在储存和运输方面仍然存在问题。现场按需生产治疗剂量的药物为这一难题提供了解决思路。微流控平台由于集成化和微型化的优势，可以将不同的功能模块集成在一块芯片上，在现场按需合成药物方面具有独特的优势。基于此，本论文设计并制作了一块微

4、流控芯片用于重组蛋白的按需合成，该芯片集成了无细胞蛋白合成（Cell-freeProteinSynthesis，CFPS）单元和蛋白纯化单元。具体研究内容包括：1.线性模板DNA修饰的琼脂糖微珠用于无细胞蛋白合成由于线性模板DNA比质粒DNA制备简单、设计灵活，可通过PCR扩增制备，而且在PCR扩增的过程中，能够根据不同的研究目的对其进行标记。因此，我们通过PCR扩增制备生物素标记的线性模板DNA，并将其修饰到链霉亲和素包被的琼脂糖微珠上用于CFPS，以增加线性模板DNA的局部浓度，提高蛋白产量。首先，以未标记的正向引物和反向引

5、物对质粒DNApET-EGFP进行PCR扩增，获得线性模板DNA；然后，以5’端生物素标记的正向引物和未标记的反向引物对线性模板DNA进行PCR扩增，即可得到生物素化的线性模板DNA；最后，将生物素化的线性模板DNA修饰到链霉亲和素包被的琼脂糖微珠上，并利用该模板DNA修饰的琼脂糖微珠在CFPS体系中合成蛋白。结果表明，模板DNA修饰的琼脂糖微珠可以在CFPS体系中成功表达增强型绿色荧光蛋白（EnhancedGreenFluorescentProtein，EGFP）。2.集成CFPS单元及纯化单元的微流控芯片用于重组蛋白的按需生

6、产在上一个研究工作的基础上，将微流控芯片与CFPS结合，并在芯片上集成蛋白纯化单元，实现重组蛋白的按需生产。该芯片由一个主通道和一个分支通道构成，主通道包含两个收缩段，分别填充线性模板DNA修饰的琼脂糖微珠和镍离子修饰的琼脂糖微珠（镍珠），构成CFPS单元和蛋白纯化单元。合成蛋白所需的原料从主通道引入，首先流经CFPS单元获得目标蛋白；接下来，反应混合液流经蛋白纯化单元，使合成的蛋白被镍珠亲和捕获；最后，从分支通道依次通入洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，即可在出口处收集到纯化的蛋白。我们用EGFP作为模式蛋白考察了芯片的性能。结果表明，

7、一块芯片一次能得到144.3μg/mL的EGFP，更换或再生镍珠后即可进行下一轮的蛋白合成与纯化。该微流控芯片平台有望通过更换线性模板DNA，实现不同重组蛋白的现场按需合成。3.无细胞蛋白合成体系用于卡那霉素免标记检测的研究V基于微流控芯片的无细胞蛋白合成与纯化研究卡那霉素是一类广谱抗生素，常用作兽药。然而，过量使用会导致其在动物源性食品中残留，人体摄入后，卡那霉素会作用于核糖体的30S亚基，影响蛋白翻译过程，引起中毒。基于此，本工作利用CFPS作为检测平台，以GFP作为报告蛋白检测卡那霉素：当卡那霉素存在时，蛋白的翻译过程受到

8、影响，使GFP的产量降低，溶液的荧光强度随之下降，从而实现对卡那霉素的免标记检测。该方法检测卡那霉素的线性范围为8-200nmol/L，检测限为8nmol/L，具有良好的选择性，同时还实现了牛奶中卡那霉素的定量检测，对食品中抗生素超标的检测具有重要意义。关键词：