蛋清源抗氧化肽对H2O2诱导的HEK293细胞氧化损伤的保护作用机制研究

《蛋清源抗氧化肽对H2O2诱导的HEK293细胞氧化损伤的保护作用机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中文摘要蛋清源抗氧化肽对H2O2诱导的HEK293细胞氧化损伤的保护作用机制研究本研究隶属于国家科技支撑计划项目《食源性功能肽生物制备技术研究》（2012BAD33B03），主要研究食源性生物活性肽对氧化应激的干预作用机制。过量自由基会导致氧化应激，具体表现为活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）的产生和抗氧化防御系统之间的失衡。氧化应激的发生，会造成酶和生物大分子的氧化损伤，如DNA、脂质、蛋白质和糖类物质等，会影响基因的表达、转录及信号的传导，干扰细胞的正常增殖、分化和凋亡，最终导致人体生物系统功能的紊乱，对机体造成不可逆的损害。癌症、

2、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生密切相关。鸡蛋作为优质蛋白质来源不仅为人体提供最基本的营养物质，蛋清蛋白及其酶解物具有多种生理功能，包括抗氧化、降血压、抑菌、免疫调节、抗粘以及抗癌等，引起了广泛的关注。生物活性肽能以多种方式发挥其抑制氧化应激的特性，包括清除自由基，抑制ROS的产生，提高抗氧化酶活性，抑制促炎细胞因子的释放等。营养素对基因表达的调控具有多层次、多途径的特点，一种有效成分可调控多种基因的表达，一种基因表达又受多种成分的调控。转录组高通量测序（RNA-seq）是一种全基因高通量转录组测序技术，它能够在全基因组范围内检测基因表达情况，

3、为更广泛的了解营养素的功能、调节机制及代谢途径提供线索。本文首先研究了蛋清源抗氧化肽体外抗氧化活性，筛选出抗氧化活性较好的四种肽WNWAD、WNW、WAD、WN；同时建立了过氧化氢（H2O2）诱导的人胚肾细胞（HEK293）氧化损伤模型，应用分子生物学手段考察了四种蛋清源抗氧化肽对H2O2诱导损伤的HEK293细胞的存活率、ROS含量、抗氧化酶活性、谷胱甘肽系统以及部分细胞因子分泌的影响，并利用RNA-Seq技术测定了H2O2诱导损伤的HEK293细胞在WNWAD作用前后的基因表达谱，筛选明显差异表达的基因，并对差异基因进行基因本体（GO）功能分析

4、和京都基因组百科全书（KEGG）信号通路分析，在细胞、基因水平探讨蛋清源抗氧化肽对H2O2所致HEK293细胞I氧化损伤的保护作用机制，为蛋清肽在氧化应激防护方面发挥的靶向作用提供有力证据。主要研究内容如下：（1）蛋清源抗氧化肽体外抗氧化活性研究采用ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率、氧自由基吸收能力（ORAC）和羟基自由基（OH）清除率四个指标对蛋清源抗氧化肽WNWAD及其拆分肽WNW、WAD、WN、AD进行体外抗氧化活性综合评价，结果表明：蛋清源抗氧化肽WNWAD、WNW、WAD和WN具有较强的ABTS自由基清除活性，并且随着浓度的增加

5、，其清除ABTS自由基能力也逐渐递增，呈浓度依赖型关系，而肽AD无ABTS自由基清除能力；蛋清源抗氧化肽WNWAD、WNW、WAD、WN和AD具有DPPH自由基清除活性，但是活性均较低，DPPH自由基清除活性最强的为100µmol/L的WN，但清除率仅为10.563%；ORAC活性最强的是五肽WNWAD，其氧自由基吸收能力约为Trolox的5.69倍。其次是WN、WAD、WNW，它们的氧自由基吸收能力分别为Trolox的4.04倍、3.96倍、2.66倍。即除了肽AD外，其余四个蛋清源活性肽WNWAD、WNW、WAD和WN的抗氧化能力均强于Trol

6、ox；蛋清源抗氧化肽WNWAD、WNW、WAD和WN对OH具有一定的清除作用，但清除作用较弱，清除率较低，在10-15%之间，并且浓度的变化与OH清除率没有完全呈规律的剂量依赖关系。（2）蛋清源抗氧化肽对H2O2诱导的HEK293细胞氧化损伤保护作用的研究利用H2O2诱导的HEK293细胞氧化损伤模型评价了蛋清源抗氧化肽WNWAD、WNW、WAD和WN对氧化应激的抑制作用。结果表明：蛋清源抗氧化肽对HEK293细胞既无促进增殖作用，也无毒性或抑制增殖作用，蛋清肽本身对实验结果无干扰；采用MTS法筛选H2O2的损伤浓度和蛋清源抗氧化肽的有效干预剂量及

7、干预时间，选择H2O2浓度400μmol/L作为诱导损伤模型的最佳浓度，干预时间为6小时；蛋清源抗氧化肽WNWAD、WNW、WAD和WN对H2O2诱导氧化损伤的HEK293细胞具有保护作用，在一定浓度范围内，蛋清源抗氧化肽对细胞存活率的影响呈浓度依赖型关系；采用DCFH-DA荧光探针对细胞内ROS含量进行检测，H2O2诱导了HEK293细胞内ROS的产生，经过蛋清源抗氧化肽预处理后，细胞内DCF荧光强度下降，细胞内ROS的水平显著降低。（3）蛋清源抗氧化肽对H2O2诱导损伤的HEK293细胞抗氧化系统影响的研II究利用H2O2诱导损伤HEK293细

8、胞构建氧化应激损伤模型，研究蛋清源抗氧化肽WNWAD、WNW、WAD和WN对HEK293细胞抗氧化酶活性及谷胱甘肽抗氧化系