CCL3通过趋化并激活中性粒细胞加重EV71感染脑损伤的机制研究

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1、CCL3通过趋化并激活中性粒细胞加重EV71感染脑损伤的机制研究StudyonthemechanismofacutebraininjuryinducedbyinteractionbetweenCCL3andneutrophilsduringsevereEV71infection作者姓名：李敏专业名称：生物化学与分子生物学研究方向：基因工程指导教师：刘松财教授学位类别：理学博士培养单位：动物科学学院论文答辩日期：2018年06月04日授予学位日期：2018年06月20日答辩委员会组成：姓名职称工作单位主席张永亮

2、教授华南农业大学委员曾林研究员军事科学院陈振文教授首都医科大学张嘉保教授吉林大学滕利荣教授吉林大学任文陟教授吉林大学前言近年来，手足口病在亚太地区广泛流行，威胁亿万婴幼儿的生命健康，仅在中国大陆，发病数年均超百万人，常位于丙类病原体发病率之首。EV71感染重症手足口病患者会伴有急性脑膜炎、脑干脑炎等中枢神经系统受损的情况。临床观察发现，EV71感染患儿从神经系统受累期到心肺功能衰竭期病情进展非常迅速，通常在48小时之内，这一阶段也是重症患儿抢救的黄金时间，但至今尚无特效的治疗药物。虽然EV71的基因组、病毒结

3、构、细胞受体和预防用疫苗研究均取得了很大进展，但其免疫致病机理的研究却进展缓慢，已成为有效治疗手足口病的主要瓶颈。对死亡患儿的解剖学和病理学研究发现，脑、脊髓中枢神经系统炎症细胞浸润明显，尤其是脑干区域，往往有明显的血管套现象，急性脑炎是公认的手足口病患儿死亡的重要原因。对重症患儿脑脊液和外周血的免疫学研究发现，中性粒细胞升高显著且存在严重的全身细胞因子风暴。然而，EV71如何导致急性脑炎？其与细胞因子风暴的关系如何？细胞因子风暴的“起暴点”及其级联机制如何？众所周知，中性粒细胞是固有免疫的主要成份，是抗感染

4、免疫的“急先锋”，通常占外周血有核细胞的半数以上，也是重要的炎性细胞。中性粒细胞在骨髓中产生，到炎症部位发挥功能，到死亡是一个受严谨调控的过程，一旦在病理条件下失调将发生严重后果，其在EV71感染引起的重症手足口病中的作用如何，又是如何发挥作用的，急需阐明。本研究针对EV71感染重症患儿的临床表现和病理学特征，我们建立了EV71感染急性脑损伤乳鼠模型；通过流式细胞术和液相多重蛋白定量技术筛选到了重症患儿和急性脑损伤乳鼠模型相一致的免疫致病候选危险因子；通过与EV71感染获得性免疫缺陷乳鼠（Rag1KO）比较，

5、发现先天性免疫反应对EV71感染引起的急性死亡发挥着重要作用；通过与EV71感染的中性粒细胞或巨噬细胞敲低乳鼠比较，发现中性粒细胞对EV71感染引起的急性死亡发挥着关键作用；通过与EV71感染的CCL3/CCL2敲低/敲除乳鼠比较，发现在EV71感染中，CCL3趋化并激活中性粒细胞引起急性脑损伤；通过对中性粒细胞进行分子生物学、生物信息学等研究，发现CCL3的表达在转录水平上受PI3K-NF-κB细胞信号通路调控，而在转录后水平上可能受microRNA调控。本研究初步阐明了EV71急性脑损伤的免疫病理机制，并

6、指出中性粒细胞和CCL3可作为EV71重症感染的潜在诊断和治疗候选靶标。I中文摘要CCL3通过趋化并激活中性粒细胞加重EV71感染脑损伤的机制研究肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)是单股正链RNA病毒、具有嗜神经性，属于微小RNA病毒科肠道病毒属人类肠道病毒A型，是近年来亚太地区手足口病（Hand，foot，andmouthdisease,HFMD）持续爆发流行的主要病原体。EV71重症感染常导致急性脑损伤（Acutebraininjury,ABI），临床上表现为严重的中枢神经系统综合征，

7、包括无菌性脑膜炎、急性整体性软瘫和脑炎。脑炎常发生在脑干，导致严重的神经源性肺水肿和心肺综合征，患儿不是快速死亡就是愈后伴有严重后遗症。目前，仍没有治疗重症手足口病患儿的特效药物。阐明EV71重症感染急性脑损伤的免疫病理分子机制，将为重症手足口病的预警、治疗提供关键的分子靶标，加速治疗重症手足口病的药物研发进度。EV71感染中枢神经系统（Centralnervoussystem,CNS）后，不仅会直接造成神经元细胞的凋亡，而且会诱导CNS不同区域的炎症细胞浸润和全身的细胞因子风暴(Cytokinestorm，

8、CS)，造成与急性脑损伤相关的中枢神经系统综合征。EV71感染导致的严重炎症可能发生在中枢神经系统的不同区域，包括脑皮质、脑干和脊髓。同时，EV71引起的以细胞因子风暴为特征的全身性炎症反应也可以引起EV71重症感染相关的疾病。虽然对EV71感染神经元细胞凋亡的分子机制认识比较深入，但是对EV71重症感染造成急性脑损伤的免疫病理分子机制的研究还处于起步阶段。本研究对EV71重症感染急性脑损伤的免疫病