功能蛋白质组学研究方法

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1、功能蛋白质组学研究方法功能蛋白质组学是指对蛋白质间、蛋白质－DNA/RNA间的相互作用的研究。以细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质为主要研究内容，由此建立细胞内外信号传递的复杂网络。蛋白质芯片技术噬菌体展示技术酵母双杂交系统蛋白质芯片蛋白质芯片是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面，形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。蛋白质芯片反应结果的检测依据被检测蛋白样品的标记种类来选择不同的检测设备。荧光标记是芯片息采集中使用

2、最多也是最成功的报告标志。杂交反后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以进行分析，将荧光信号转成数据，即可获得有关生物信息。蛋白质芯片分类根据固定介质的不同,可以分为两大类:化学型蛋白质芯片（SELDI-TOF-MS蛋白质芯片）生物型蛋白质芯片（如抗体、受体、配体等）；根据片基材料的不同可以分为：膜芯片、玻璃芯片和液相芯片等。目前常用蛋白质芯片有：1.SELDI-TOF-MS蛋白质芯片2.抗体芯片3.靶蛋白质芯片4.液相蛋白质芯片SELDI-TOF-MS蛋白质芯片表面加强激光解吸电离-飞行时间质

3、谱(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtimeofflight-massspectrometry，SELDI-TOF-MS）蛋白质芯片由３部分组成：蛋白质芯片、阅读器和分析软件。蛋白质芯片是核心部分，芯片上固定的介质可以是阴离子、阳离子、疏水性、亲水性、金属等，根据蛋白质的化学特性而有选择性地捕获特异的蛋白质。ＳＥＬＤＩ技术的基本原理:将待测样品滴到芯片表面(血清、尿液、分泌液、细胞裂解液等)，通过亲合作用样品中的某些蛋白质被吸附到芯片的固相基质表面上，用缓冲液洗去芯片上的杂

4、质蛋白和其他污染物，然后在芯片上加入能量吸收分子（energyabsorbingmolecular,EAM），芯片干燥后，在真空管中用激光轰击，蛋白质在吸收能量后被解析发生离子化，在电场力作用下脱离芯片表面，被离子检测器所检测。检测结果经过软件分析处理后，可绘制出质谱图，显示相关蛋白质的分子量、含量等信息。抗体芯片抗体芯片主要研究在不同生理或病理状态下蛋白质水平的量变。微型化、集成化、高通量化是抗体芯片重要特点。芯片上排列了许多已知蛋白质的单克隆抗体，这些单克隆抗体对应的蛋白质（抗原）都是细胞结构和功能上十分重要的蛋白，涉

5、及信号传导、肿瘤、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡等广泛的领域。抗体芯片检测的结果不是蛋白质的绝对含量而是目的蛋白质在两个样品之间的相对峰度。靶蛋白质芯片主要用于蛋白质相互作用研究、蛋白表达研究和小分子蛋白结合研究。靶蛋白质的获得：1.化学合成；2.基因工程表达蛋白质并进行纯化点样制作芯片；3.将活的生物体(如细菌、酵母等)在芯片上原位表达蛋白质（living芯片）。4.将核酸固定在芯片介质中，然后利用不依赖细胞的体外蛋白表达系统，在原位合成靶蛋白。液相蛋白质芯片是一种新型的、高度灵活的多元蛋白质研究平台，可以适用于蛋白质

6、组研究、临床研究和药物研究中的各种蛋白质分析。液相芯片体系由许多不同的小球体为主要基质，每种小球体上固定有不同的探针分子，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了一个液相蛋白质芯片系统。在液相系统中，为了区分不同的探针，在球形基质的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种红色分类荧光的比例不同(色彩编号)，区分不同的探针。可同时固定各种蛋白质、多肽、核酸等生物分子，可以对同一个样品中的多个不同的分子同时进行检测。噬菌体展示技术自1985年SmithGP等创建噬菌体展示技术，其原理是：以经过改建的噬菌体为载体

7、，把外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因PⅢ区或PⅧ区，从而使表达的外源肽或蛋白质展示在噬菌体的表面，并使表达产物保持良好的空间构象。进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，最终获得具有特异结合性质的多肽/蛋白质。这一技术有效地实现了基因型和表型的体外转换，即在二者之间架起了联结的桥梁，使得研究者完全可以在分子克隆的基础上，有效地实现蛋白质构象的体外控制，从而可以在体外获得具有良好生物学活性的表达产物。Navagen公司用T7噬菌体构建的各种cDNA表达文库，将外源基因序列插入到编码T7噬菌体包膜蛋白基因中，插入片段

8、基因长度可在300bp～3000bp之间，所表达的多肽或蛋白质以与噬菌体包膜蛋白融合的形式展示在噬菌体表面，大小在50个～1200个氨基酸。T7噬菌体展示文库可以展示相当部分表达的蛋白质，甚至可以保持蛋白的一定构象。因此，该系统最大程度地再现了细胞内的真实情况，所筛选出的结合蛋白与自然状态较为接近。目前