阿维菌素抗性、敏感小菜蛾转录组分析及CYP340W1基因功能分析

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1、摘要摘要小菜蛾起源于地中海地区或南非地区，但这种农业害虫现在广泛分布于世界各地。小菜蛾危害严重，往往可以导致９０％以上的作物损失。最近的研宄估计，每年由小菜蛾４０－５００造成的经济损失高达亿美元年代起，小菜蛾逐渐成为十字花科蔬。自上个世纪７菜的主要害虫，在中国绝大部分十字花科作物主产区都有发生。阿维菌素自问世以来就被用作防治小菜蛾的主要药剂而被广泛使用。然而，快速增长的阿维菌素抗性对这种小菜蛾防治策略产生了威胁。２００７年在我国云南地区采集的小菜蛾的阿维菌素抗性倍数甚至高达５０００。本实验室饲养的抗性品系小菜蛾（Ａ

2、ＢＭＲ）长期使用阿维菌素汰选。，倍与敏感品系小菜蛾（ＡＢＭＳ）相比，抗性品系小菜蛾的抗性倍数髙达２１７．６８倍。为．了明确＋菜蛾阿维菌葷抗性的分子机制，通过转录组来分析河雒菌素抗性、敏感，：品系小菜蛾的转录水平差异。抗性、敏感品系各设置３个生物学重复。总计获得了大约４５Ｇｂ的数据，平均每个样品获得了７．６Ｇｂ数据。敏感品系（ＡＢＭＳ）获得了２１９，２１４，５７６，其中４９９５ａｄｓ可条ｒｅａｄｓ．％的ｒｅ以比对到小菜蛾基因组上。抗性品系（ＡＢＭＲ）获得了１２６，１８５，７０８条ｒｅａｄｓ，其中约有５２．７２％可以

3、比对到小菜蛾基因组。在筛选标准为ｐａｄｊ＜０．０５＇的条件下，共有７６个上调和６５个下调基因差异表达。ＧＯ聚类分析发现，１４１个差异转录本被归为３０个ＧＯｔｅｒｍ，主要为生物学过程、代谢过程、催化活性、有机物代谢过程、．■大分子代谢过程。．．昆虫的细胞色素氧化酶Ｐ４５０的催化作用对昆虫抗药性的形成起到了重要作用。转录组数据分析发现Ｐ４５０基因在抗性品系中的上调表达是导致阿维菌素抗性的重要因素一一之。本研宄首次报道了个新的Ｐ４５０基因，利用ＲＡＣＥ技术克隆得到小菜蛾Ｐ４５０基因全长，该基因被命名为隶属于ＣＹＰ４家族。

4、该基因开放阅读框（ＯＲＦ）＇＇一－－４９１５，。长１？，５１；丁１１长１３９５？３１０＾长２９９匕？，其中包含个长２６５口的？〇＾＾尾基因编码４９６个氨基酸，蛋白分子量５６Ｋｄａ，等电点为９．１８。本研宄所获得的小菜蛾的基因具有典型的细胞色素氧化酶Ｐ４５０超家族的保守结构域，即血红素保守结ｘｘｘｘ合区，其氨基酸序列为ＰＦＧＲ〇Ｇ／Ａ，包含绝对保守的半胱氨酸。基因在抗性品系小菜蛾（ＡＢＭＲ）四龄幼虫中的表达量显著高于敏感系，差异倍数达到５．６６倍。该基因的表达还受到阿维菌素的影响。小菜蛾幼虫接触阿维菌素将会导致Ｐ

5、４５０基因转录水平的变化。小菜蛾幼虫词喂阿维菌素７２小时后Ｃ１Ｔ以０奶基因的表达量显著升高１．５倍。本实验利用显微注射ｄｓＲＮＡ技术介导的ＲＮＡ干扰来研宄扣奶基因的功能，结果显示基因可能与小菜蛾的阿维菌素抗性相关。小菜蛾幼虫注射ｄｓＲＮＡ并饲喂阿维菌素７２ｈ后，幼虫的死亡率显著升高。幼虫生测结果表明：注射ｄｓＲＮＡ的三龄幼虫饲喂２．５ｍｇ／Ｌ阿维菌素后死亡率为８６．７％，显著高于对照组的５６．７％。因此，这个新Ｐ４５０基因代谢阿维菌素的能力在小菜蛾阿维菌素抗性中起到重要作用。此外，本实验构建了重组表达载体用于异源表达

6、。以大肠杆菌菌株ＴｒａｎＳＳｅｔｔａ（ＤＥ３）作为原核表达宿主，重组载体转化至宿主细胞后，对表达条件进行了优化。重组表达该Ｉ东北农业大学农学博士学位论文°基因的最优培养条件为于１６Ｃ添加０．０１ｍＭ的ＩＰＴＧ。最后，利用免疫印记法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）确认了重组蛋白的成功表达。关键词：小菜蛾；转录组测序；Ｐ４５０；ＲＮＡ干扰ｎＡＢＳＴＲＡＣＴＴｒａｎｓｃｒｉｔｏｍｅＡｎａｌｓｉｓｏｆＡｂａｍｅｃｔｉｎＲｅｓｉｓｔａｎｔａｎｄｐｙＳｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅｓｔｒａｉｎｓｏｆＤｉａｍｏｎｄｂ

7、ａｃｋＭｏｔｈａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＡｎａｌｓｉｓｏｆＣＹＰ３４０Ｗ１ｙＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋｍｏｔｈ，Ｐｌｕｔｅｌｌａｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ：Ｐｌｕｔｅｌｌｉｄａｅ），ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇｆｒｏｍｔｈｅＭｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎｏｒＳｏｕｔｈＡｆｒｉｃａｂｕｔｎｏｗｉｓｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄａｌｏｂａｌｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄａｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ，ｇｙｇｉｔｔ．Ｐ，ｌｔｌｌｌｔｈ９０％ｔｓｔｔｉｔｄｎｓｅｃｐｅ

8、ｓｘｙｏｓｅａｃａｎｃａｕｓｅｃｒｏｐｏｓｓｅｓｏｆｍｏｒｅａｎ．Ａｒｅｃｅｎｕｄｙｅｓｍａｅｔｈ－ｅｔｏｔａｌａ