可注射性脱钙骨基质的水凝胶制备及性能检测

《可注射性脱钙骨基质的水凝胶制备及性能检测》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号：R681.5学校代码：10062密级：学号：2014701084博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：可注射性脱钙骨基质的水凝胶制备及性能检测TITLEPreparationandPropertiesofinjectablehydrogelsderivedfromdemineralizedanddecellularizedboneextracellularmatrix一级学科：临床医学二级学科：外科学骨外科论文作者：黄洪超导师：马信龙教授天津医科大学研究生院二零一七年十一月分类号：R681.5学校代码：10062密级：学号

2、：2014701084学位类别：科学学位专业学位√学科门类：医学博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：可注射性脱钙骨基质的水凝胶制备及性能检测TITLEPreparationandPropertiesofinjectablehydrogelsderivedfromdemineralizedanddecellularizedboneextracellularmatrix一级学科：临床医学二级学科：外科学骨外科论文作者：黄洪超导师：马信龙教授天津医科大学研究生院二零一七年十一月天津医科大学博士学位论文中文摘要研究目的、方法目的：选

3、取新鲜猪股骨的松质骨经过脱脂、脱钙、脱细胞，制成ECM材料，在一定条件下诱导生成脱钙、脱细胞水凝胶，检测并描述其理化结构特点，通过体外人脐带MSCs混合培养实验检测松质骨ECM水凝胶的组织相容性，为骨组织工程提供一种具有可注射性的ECM水凝胶植骨材料奠定实验基础。方法：我们获取猪龄为12-24个月的新鲜猪股骨，将新鲜猪股骨中的松质骨处理成大小5mm×5mm×5mm颗粒骨，蒸馏水反复清洗颗粒骨,直到松质骨里面的血液清洗干净，晾干后，4℃条件下使用甲醇及氯仿按照1:1体积混合，使用磁力搅拌器搅拌脱脂，24小时换液一次，48h后，蒸馏水反复清洗颗粒骨，室温晾干

4、，4℃条件下混合0.6mol/L盐酸（HCL）后使用磁力搅拌器搅拌脱钙，300ml0.6mol/L盐酸加入10g松质骨颗粒放在大烧杯中，调整搅拌器搅拌速度，形成小的漩涡即可，24小时换液一次，脱钙48h。颗粒骨用去离子水反复清洗，至溶液pH值呈中性，室温晾干。使用1%的TritonX-100混合颗粒骨后，4℃条件下磁力搅拌器搅拌脱细胞24小时，用去离子水反复清洗彻底后，室温晾干，颗粒骨与DNaseI和RNase混合液震荡处理12小时，脱去细胞中的DNA，颗粒骨用去离子水清洗后放-20℃存放过夜。冷冻颗粒骨置于冻干机中冻干24小时，制成冻干ECM，灭菌后-

5、20℃保存备用。1gECM加入0.01mol/LHCL10ml和100mg胃蛋白酶消化，4℃条件下用磁力搅拌器搅拌48h，直至固体颗粒完全消化。制备不同浓度配比的脱钙骨基质ECM水凝胶，水凝胶的终浓度分别为4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml；pH酸度计检测液态水凝胶pH值，恒温箱内测定其37℃成胶时间；观察标本大体，扫描电镜检测水凝胶孔隙结构，细胞核染色和DNA定量评估脱细胞效果。脱细胞基质主要成分是胶原和粘多糖(GAG)及成骨活性因子，检测水凝胶的DNA、胶原、粘多糖含量，水凝胶标本做甲苯胺蓝染色、蕃红O染色、Ⅰ型胶原的免疫组织化

6、学染色，4种不同浓度的标本成胶动力学检测和力学检测。ECM水凝胶冻干品利用钴60使用25kGy的放射剂量灭菌后，将人脐带MSCs接种在水凝胶表面，通过CCK8细胞毒性检测和细胞死活实验来评估水凝胶的细胞相容性和可渗透性。通过ALP染色、茜素红染色、VanGieson染色来验证水凝胶的骨诱导活性。最后利用经皮注射的鼠模型评估水凝胶的可注射性和组织相容性。I天津医科大学博士学位论文结果：恒温箱中37℃约20-60min成胶，松质骨ECM水凝胶外观晶莹剔透，表面光滑湿润，富含水分，具有弹性，用金属剥离子轻压后可迅速回弹，水凝胶冻干品在体式显微镜下观察成孔性好，

7、孔隙大小近似一致，分布一致，类似海绵，外观奶白色，有弹性。SEM结果显示富含孔隙，互相交通，孔隙大小300.1±38.12μm；ECM水凝胶吸水率为975±85%。HE染色显示无细胞核及细胞膜相关的残留。甲苯胺蓝染色显示胶原阳性、蕃红O染色显示GAG阳性、Ⅰ型胶原的免疫组织化学染色阳性。ECM水凝胶双链DNA含量1.3±0.3ng/mg干重，DNA含量低于50ng/mg干重的脱细胞标准。胶原含量0.93±0.06µg/mg干重，水凝胶蛋白聚糖含量8.78±0.12µg/mg干重，10mg/ml水凝胶压应力强度300±21Pa。水凝胶成胶动力学呈S型。CC

8、K8细胞毒性检测及细胞死活实验表明水凝胶对于细胞增殖无明显影响。与水凝胶混合培养