昆明医学院第二附属医院检验科

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1、昆明医学院第二附属医院检验科杨红英酶免疫技术放射免疫技术发光免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术酶免疫技术--三大经典标记技术之一三大经典标记技术：主要试剂:酶标记的抗体或抗原酶标物特点：免疫学活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性酶免疫技术的原理及特点酶免疫技术的原理酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析特点抗原抗体反应的特异性与酶高效催化反应的专一性相结合灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间

2、保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联，衍生出适用范围更广的新方法。酶及作为标记酶的要求活性高：低浓度底物，高催化反应有与抗原、抗体共价结合的集团标记后不影响稳定显色信号易于判断和测量底物易于配制保存且对人体无害酶及底物价廉常用酶-辣根过氧化物酶（HRP）来源于植物特点：糖蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）的结合物纯度用纯度数（RZ）表示，与酶的活性无关，酶活性以单位U表示。酶变性后RZ不变但活性降低。优势：容易获得、价廉、稳定常用于ELISA常用酶-碱性磷酸酶（AP）来源于大肠杆菌或小牛肠

3、黏膜，二者的理化性质不同。特点：敏感性高于HRP，本底低。不容易获得高纯度制剂，稳定性低、价格高。多用于均相酶免疫测定HRP的常见底物邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS常用底物常用底物邻苯二胺OPD：OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。缺陷：不稳定，致癌。常用底物四甲基联苯胺TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm。优势：稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。

4、需注意在溶液中不稳定酶免疫技术的核心组成部分酶结合物（conjugate）酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物酶标记抗体或抗原抗原要求纯度高，抗原性完整抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。制备方法要求酶标记抗体或抗原制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定，不形成聚合物酶标记抗体或抗原制备方法戊二醛交联法酶标记抗体或抗原改良过碘酸钠法戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白

5、质分子中的氨基结合该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。改良过碘酸钠法过碘酸钠氧化酶的多糖羟基为醛基，醛基+抗体蛋白中的游离氨基→Schiff碱，Schiff碱+硼氢化钠→稳定的酶标志物常用于HRP标记抗体或抗原纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯酶标记抗体或抗原

6、固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面固相载体要求结合抗体或抗原的容量大抗体或抗原牢固地固定在其表面不影响免疫反应性利于反应充分进行固相方法简便易行，快速经济种类塑料制品微颗粒膜载体固相载体将抗原或抗体结合于固相载体用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附包被coating封闭blocking包被与封闭酶免疫技术分类酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免

7、疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位液体标本中抗原或抗体的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。原理均相酶免疫测定最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique克隆酶供体免疫分析CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay均相酶免疫测定EMIT示意图

8、(enzyme-multipliedimmunoassaytechnique）CEDIA示意图（clonedenzymedonorimmunoassay）分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物非均相酶免疫测定酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassy，ELISA）底物显色定性或定量的分析原理包被