鸡球虫病的中药防治与DNA疫苗研究

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1、浙江大学动物科学学院博士学位论文鸡球虫病的中药防治与DNA疫苗研究姓名：杜爱芳申请学位级别：博士专业：动物营养与饲料科学指导教师：胡松华20040501杭州市科技局重点科研资助项目鸡球虫5401基因的克隆及其表达产物的研究与开发(项耳编号：2001112814)浙江人学博十学位论文摘要鸡球虫病是一种重要的寄生虫病，分布广，感染率高，常发生在15-50目龄的雏鸡，若不能有效控制，其现场发病率可达50％一70％，死亡率可达20％一30％，严重爆发时其死亡率可高达80％。据统计，全球养鸡业每年仅球虫病造成经济损失就达20亿英镑。目前

2、对该病的防治仍以化学合成药及抗生素为主，但由于长期应用，易产生抗药性，且在畜产品中因药物残留而影响人类的健康。鉴此，人们将目光转向非抗生索防治研究，如中药和疫苗。沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌，通过一定方法减毒后对宿主致病性显著降低，但仍保留良好的侵袭力，可携带重组质粒侵入脾和淋巴结等器官组织，并在宿主细胞中表达抗原而诱发特异性的免疫应答反应。以减毒沙门氏菌为载体的疫苗已用于细菌和病毒性疾病的预防研究，但国内未见以减毒沙门氏菌为载体传递鸡球虫基因疫苗的相关报道。本研究目的是：1)分离鉴定杭州地区鸡球虫种类；2)用中药复方进行鸡球虫

3、病防治试验；3)克隆主要致病虫种柔嫩艾美耳球虫(￡tene]la)ZJ株5401基因，构建原核和真核表达质粒，利用减毒鼠伤寒沙门氏菌基因双突变株为载体传递EteneJlaZJ株DNA疫苗，研究其免疫原性及可行性。本研究对杭州地区鸡场的球虫感染情况进行了调查，并用中药复方对实验感染球虫鸡进行防治试验。调查和防治结果表明，杭州地区主要存在3个种，即柔嫩艾美耳球虫(E据月Pl妇)，毒害艾美耳球虫(￡J，7poatrix)和巨型艾美耳球虫(Emaxima)；中药复方煎剂对鸡柔嫩艾美耳球虫具有高效抗球虫效果，抗球虫指数(ACI)为180

4、．8；中药复方散剂具有中等抗球虫效果，ACI为178．8。应用RT-PCR扩增叵tenellazJ株5401基因。按照Oanforth(1989)发表的基因序列合成引物，引物上下游各加上EcoRI和盛lI酶切位点。PCR扩增产物约为900bp，与pGEM—T载体连接后，转化DH-5d感受态细胞，将酶切鉴定正确的阳性克隆进行测序。结果表明，EtenellaZJ株5401基因序列全长为864bp，序列本身是一个开放阅读框，与Danforth等(1989)报道的基因序列的同源性为99．8％，有两个部位的碱基发生了有义突变；氨基酸序列

5、同源性为99．3％。同时将5401基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a中，构建成表达载体pET一30a一5401，用IPTG诱导该基因在EcoliBL21(DE3)中表达，诱导6h的蛋白表达量即可达到较高水平，表达量约26．3％。SDS—PAGE及Western—blot证明，融合蛋白大小约为66kDa，而非推测的38．5kDa，表明该基因可能以蛋白二聚体的形式表达。将5401基因插入真核表达载体pcDNA3，构建成真核表达质粒pcDNA3—5401，高压电转化dam和phoP基因双突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌(ZJili株

6、)中，并直接转染Vero细胞，提取细胞总DNA，DIG标记探针可检测到阳性杂交信号。8DS～PAGE、Western—blot可检测到31k0的蛋白条带。结果表明减毒沙门氏菌能将5401基因呈递给Veto细胞并进行表达。将携带鸡柔嫩义美耳球虫5401基因的真核表达质粒pcDNA3—5401的减毒沙门氏菌ZJIil菌株(ZJIli／pcDNA3—5401)口服接种3日龄非免疫鸡，2周后加强免疫一次，试验过程中未见任何不良反应和鸡只死亡。二免后4周各组鸡的体重无统计学差异(P>O．05)，同时肝脏和脾脏已检测不到沙门氏菌；用限制性

7、酶切分析和PCR鉴定证实，体内试验和体外培养的重组质粒在受体菌zJlll菌株内比较稳定。结果提示，利用减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗具有良好的安全性和稳定性。为了探讨其免疫原性和免疫保护效果，将ZJllI／pcDNA3—5401分别以107cfu、i08cfu、i09cfu的剂量进行首免，2周后进行二免，一免后每周采血进行淋巴细胞增殖试验和特异性抗体检测，持续6周，测定其免疫原性。二免后一周每组随机取12羽鸡，每羽用6xi04个正tenefIaZJ株孢子化卵囊攻毒，攻虫后第8天，所有鸡称重、剖杀、取其盲肠，观察盲肠病变，对盲

8、肠内容物进行卵囊计数。结果表明：重组减毒沙门氏菌ZJliI／pcDNA3—5401株三个剂量组均能显著增强淋巴细胞增殖水平和抗体水平(P