基因组学与分子生物学实验技术

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1、Chapter6 基因组学与分子生物学实验技术6.1 基因组学6.2 分子生物学实验技术6.1 基因组学1、产生背景及概念Ø背景：1985年提出HGP，随着 HGP的提出和实施，产生了基因组学。Ø概念：以分子生物学技术、计算机技术和信息网络技术为研究手段，以生物体内全部基因为研究对象，在全基因背景下和整体水平上探索生命活动的内在规律及其内外环境影响机制的科学。2、基因组学分类Ø根据研究对象分：肿瘤基因组学、植物基因组学、药物基因组学、环境基因组学等。Ø根据研究的重点分：结构基因组学、功能基因组学3、结

2、构基因组学Ø概念和目的以全基因组测序为目标的基因结构研究，弄清基因组中全部基因的位置和结构，为基因功能的研究奠定基础。其目的是建立高分辨的遗传图谱、物理图谱、转录图谱和序列图谱。Ø遗传图谱（连锁图谱）：指基因或 DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离。CM 表示（基因或 DAN 片段在染色体交换过程中分离的频率）。通过该图谱可分清各基因或DNA 片段之间的相对距离与方向，如靠近着丝粒或端粒。Ø物理图谱：指 DNA序列上两点间的实际距离。用于确定各遗传标志间的物理距离有两种物理图谱：（1）以已定位的D

3、NA序列标记位点（STS）为位标，以DNA 实际长度为图谱距离的基因组图谱。（2）由YAC和/ 或细菌人工染色体（BAC）连续克隆重叠群组成的物理图谱。Ø转录图谱（表达图谱）：以EST（表达序列标签肽）为位标，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱，它是染色体 DNA某一区域内所有可转录序列的分布图，是基因图的雏形。技术：用已在染色体定位的YACDNA 或 BAC DNA为探针，与所有可能相关的各组织 cDNA文库杂交，寻找其同源克隆并做进一步分析。Ø序列图谱（分子水平的物理图谱）：以某一染色体上所含的全

4、部碱基顺序绘制的图谱。既包括可转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、调节序列和功能未知序列的总和。4、功能基因组学与蛋白质组Ø功能基因组学概念：利用结构基因组学提供的信息，以高通量，大规模实验方法及统计与计算机分析为特征，全面系统地分析全部基因的功能。研究角度包括：生物学功能、细胞学功能、发育学功能等。Ø蛋白质组概念：某一物种基因组所能表达的全部蛋白质的组合即5、反向遗传学：在已知基因序列的基础上研究基因的生物学规律，通过功能丧失突变体研究其表型效应。通过同源重组，用突变的基因取代野生型基因，导致功

5、能丧失突变体，进行反向遗传学研究。传统遗传学（正向遗传学）主要研究自发或诱发突变体中某一性状的遗传行为，如控制突变性状的基因数目及其在染色体上的位置、突变性状在后代中的传递规律等。反向遗传学筛选到的突变体有时无突变表型效应的原因：突变表型效应需在特定环境中才表现；基因家族中其他基因功能的代偿。6、现代基因组学的发展需要依赖于分子生物学技术的应用！ØDNA序列分析、DNA芯片技术ØcDNA药物基因组学克隆ØDNA序列的体外扩增与检测Ø转基因基因技术、基因异体表达、基因敲除、基因沉默技术等eg:RNAi、

6、micRNA、PNA技术、Ribozyme…… 6.2 分子生物学实验技术所有生命科学实验都是基于差异。在遗传学上我们必须找到突变体，才能够知道一个基因到底有什么作用，到底多么重要；在各种生化实验上，我们必须设置对照，看看目标根对照有什么差别。6.2.1DNA凝胶电泳1、基本原理：一种分子在一定的电场中由于其本身所带电荷性质与电量的不同迁移的方向与速率也各不一样，据此可将不同的分子在电场中区分开来。DNA 分子带负电荷，在电场中迁移速率通常与其荷质比成正比，分子量越大，迁移率越小；相同分子量的DNA中

7、构象压缩越紧密的迁移率越大（如 ccc型 DNA比 L型和 oc型质粒迁移率大）2、琼脂糖（agrose）凝胶电泳琼脂糖浓度：一般0.7%的agrose即可，但是如果有特殊需要（如所分离检测的DNA 片段太大或太小，则浓度可作调整）电泳电压：60—100V 指示剂（上样缓冲液）：含有溴酚兰，指示DNA迁移位置Ø基本流程：§制胶：称取适量的agrose，加入电泳缓冲液（TAE/TBE），加热至熔化备用§倒胶：将胶槽洗净后晾干，摆好梳子，agrose冷却至65℃时倒入胶槽，注意不要产生气泡，胶槽放置应水平

8、。§上样：待凝胶冷却凝固后，拔取梳子，放入电泳槽，加入电泳缓冲液，并用移液枪赶走点样孔中的气泡，以移液枪将混有上样缓冲液的DNA样品注入点样孔，注意不要刺穿凝胶，同时点上 ladde（或r Marker，标准DNA）作为参照。§电泳：60—100V电泳 40min左右（根据溴酚兰的迁移位置终止电泳）§显色观察：将凝胶放入含有 EB（溴化乙锭）（0.5mg/ml 左右）的工作液中显色 5min，在紫外线下观察电泳结果3、脉冲电场凝胶电泳（pulsedfie