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《大肠杆菌质粒DNA提取方法的优化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第16卷第6期:42生物技术Vol116,No16:422006年12月BIOTECHNOLOGYDec12006技术与方法TECHNIQUEANDMETHODS大肠杆菌质粒DNA提取方法的优化王友如(湖北师范学院生物系,湖北黄石435002)摘要:目的:简化操作流程,缩短提取时间,降低试验对操作者的危害。方法:该方法去除酚、氯仿等有害试剂,采用LiCl沉淀去除质粒制备物中小片段核酸(包括DNA和RNA);工程菌生长至对数期时通过加入氯霉素后不仅方便质粒DNA的提取过程中蛋白质的去除,而且可使质粒的拷贝数进一步增加,提高质粒DNA产量的目的。结果:实验改进
2、方法所提取的质粒DNA产量高于常规方法,达到20μgPmL。结论:改进方法提取的质粒DNA,其下游的内切酶消化,PCR、重组质粒鉴定、转化大肠杆菌等实验的结果和重复性都令人满意,完全可用于一般的分子生物学研究。关键词:质粒;DNA提取;方法改进;纯化中图分类号:Q782文献标识码:A文章编号:1004-311X(2006)06-0042-03AModifiedMethodforIsolationofPlasmidDNAfromE.coliWANGYou-ru(TheDepartmentofBiology,HubeiNormalUniversity,Huan
3、gshi435002,China)Abstract:Objective:TosimplifytheprocessofextractionofplasmidofDNA,shortenthetimeofextractionofplasmidofDNA,clearthedamagetothemanipulator.Methods:Hydroxybenzeneandchloroformwasexcludedduringtheprocess,LiClwasusedtoprecipitatethesmallfragmentsofDNAandRNA,chloramphe
4、nicolwasappliedtoenhancetheyieldofplasmidDNA.Results:TheyieldofplasmidDNAobtainedbythemodifiedmethodwashigherthatobtainedbynormalone.Conclusion:Themodifiedmethodisquitesimple,rapid,economicalandreliable.ThequalityofplasmidDNApreparedbythismodifiedmethodcanextensivelymeettherequire
5、mentsformanymolecuarbiologyexperiments.Keywords:plasmid;extractionofDNA;modifiedmethod;purification大肠杆菌质粒DNA的提取和检测在分子生物学中是常见1.1.2.5LiCl(8molPL):100mL。的实验,常规的碱裂解法提取质粒DNA产物中常带有影响酶1.1.2.6NH4AC(8molPL):100mL。切等下游实验的大量蛋白质和盐等污染物,提取的程序比较1.1.3仪器:离心机;PCR仪;凝胶成像系统。[2]复杂,所使用的试剂对人体有害,并且得率相对较低,
6、实验结1.1.4培养基:LB培养基,按《分子克隆实验指南》说明配制。[1-4]果也很不稳定。本实验的创新的点在于结合了常规碱裂1.2方法解法和Mini质粒提取的优点,在工程菌生长至对数期时加入1.2.1含重组质粒DNA细胞的培养与收集氯霉素抑制细菌蛋白质的合成,但不影响松弛型质粒DNA的将含有质粒CyPA的M15菌种接种在LB固体培养基(含复制,为质粒DNA的提取过程中蛋白质的去除提供了方便,还50μgPmLAmp)中,37℃培养12-16h。挑取转化细胞的单菌落,可以达到提高质粒DNA产量的目的,由于细菌长期受到抑制接种到50mLLB液体培养基(含50μ
7、gPmLAmp)中,37℃振荡培使裂解液中的黏稠度显著降低,向培养基中添加氯霉素比处养约12-16h(当菌液生长到对数期OD600=0.4-0.6在培养理黏稠的裂解液更方便,同时利用LiCl沉淀RNA,并简化操作液中添加适当体积的34mgPmL的氯霉素,使其终浓度为流程,使提取时间缩短,并且在操作过程中去除了酚、氯仿等170μgPmL)。对人体有害的试剂,使试验本身对操作者的危害得以降低,从1.2.2优化的碱裂解法提取质粒DNA而建立了一套完整、便捷、质粒DNA得率和纯度高、且相对比(1)12000rPmin离心30s,收集1.5mL培养物中的菌体,尽较安
8、全的大肠菌质粒DNA的提取方法,可直接用于PCR和限量弃尽上清,倒
