农田中洋葱伯克氏菌基因型及其与医院同类致病菌的比较研究

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1、浙江大学博士学位论文农田中洋葱伯克氏菌基因型及其与医院同类致病菌的比较研究姓名：罗远婵申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：谢关林20060501浙江大学博士学位论文摘要洋葱伯克氏菌(占“放^o如招r拯c印8c缸)是一种广泛存在于农业环境和医院的革兰氏阴性细菌，现被国际上划分为9个基因型，合称洋葱伯克氏菌群(B．c印口c妇㈣1ex’简称Bcc)。Bcc虽然引起洋葱酸皮病，但国内主要作为生物农药在应用。目前国内外报道该菌引起洋葱伯克氏综合症而致多人死亡。现有研究显示Bcc菌中生物农药菌、植物致病菌和人体条件致

2、病菌难以区分。我国无人涉足Bcc菌基因型及其与医院致病菌的比较研究。我国农田中存在哪些Bcc基因型、它们是否与医院同类致病菌一样危险等问题急待解决。本研究从广西、浙江、海南、河北4省共采集农田灌溉水和土壤样本43份，用选择培养基Bcc富集液分离Bcc菌株，经表型特征鉴定后确定所分离的细菌菌株中有26个为Bcc菌株。从辽宁、浙江2省的医院获取并用表型特征鉴定Bcc菌株41个。研究表明Biolog和脂肪酸分析(ⅣMEs)均只能将Bcc鉴定到种的水平，而无法鉴定到基因型。由于各基因型Bcc菌株间同源性极高，常用的细菌分

3、子鉴定手段16sr王ⅢA基因序列比较无法区分各基因型。本研究采用recA基因区分Bcc各基因型菌株，同时比较了recA特异引物PcR扩增和recA全序列分析的方法与表型鉴定方法的差异，经表型鉴定方法定为Bcc的67个菌株中只有59个被确证为Bcc菌株，其中农田菌株25个，医院菌株34个，Biolog和FAMEs对Bcc菌的误鉴定率为11．94％。农田菌株中检测到基因型I、II、Ⅳ和V，其中基因型I为优势类型，其次是基因型V；医院菌株中检测到基因型I、Ii、IⅡA、mD和V，其中基因型ⅢA为优势类型，它是引起洋葱伯

4、克氏综合症的主要基因型，但同时也发现医院存在较高比率的基因型I菌。rccA特异引物PcR扩增法是针对医院Bcc菌株的基因型鉴定设计的，该法操作简便、准确率较高可以作为初步鉴定Bcc基因型的主要手段，但是由于一些基因型recA特异引物的缺少(如基因型Ⅸ)和对农田菌株灵敏度不够高(如基因型II)，因此rccA全序列分析是鉴定和确证Bcc基因型不可或缺的手段。研究还表明一些菌株的基因型与其在TsA平板上的菌落特征有一定的对应关系，通常基因型I菌株菌落均为黄绿色、基因型Ⅳ菌落接近无色、基因型Ⅲ的菌落多为乳白色。浙江大学博

5、士学位论文对农田优势基因型一基因型I菌株与医院基因型I菌株进行了区分，结果显示，两者在rccA基因的限制性片段长度多态性分析(RFLP)、rccA基因全序列分析及烟草过敏反应中无差异：而利用模式植物苜蓿替代动物模型对动物毒性的检测可以明确区分开基因型I农田菌株和医院菌株，这为我们在农业和环保中安全利用Bcc奠定了坚实的基础。本研究利用模式植物苜蓿对不同来源的基因型I菌株进行区分，这是国内外的首次尝试并获得成功，但其中的作用机理有待进一步研究。利用所建立的苜蓿植物模型代替动物模型在国内首次开展农田置c印。c缸不同基

6、因型菌株对动物毒性的测定，发现分离到的农田菌株对动物的毒性明显弱于医院菌株。除LMGl222(洋葱酸皮病菌)外所有参试基因型I农田菌株、基因型II和Ⅳ菌株对苜蓿致病率与清水对照(CK)差异未达极显著水平；所有基因型I医院菌株及基因型Ⅲ医院菌株对苜蓿致病率与cK差异极显著；基因型V农田菌株中3个菌株对苜蓿致病率与CK差异未达极显著水平，而其余4个与CK差异极显著，但都与该基因型医院菌株对苜蓿致病率差异极显著。59个Bcc菌株对3个病原细菌和1个病原真菌的离体拮抗活性显示，它们对病原细菌的拮抗性不是很明显，但对病原真

7、菌的效果较好，其中农田基因型I菌株91对蔬菜灰霉病菌有明显的抑制作用，而且在模式植物上检测结果表明该菌对动物安全，具有开发为生防制剂的潜力。关键词：洋葱伯克氏菌群；鉴定；基因型；农田菌株：医院菌株；区分；毒性测定；苜蓿：拮抗细菌Il浙江大学博士学位论文AbstractThe曰“，肼D埘P啦cE阳c记isa蓼锄一ncgativebact嘶umwidelydis砸butedinagricul删andcliⅡicalenvir0咖ent．Ithasbeendividedi11to9gellomovarscallcdBH

8、rMDf如一口c叩口c缸compl旺(Bcc)．ThestrainsofBcchadbecnmainlyusedasbi010百calcon呐lagentinC11ina，mou曲someoft11emwereⅡleonionpa山og肌soroppo枷sticpamogensofhumanscausing‘‘c印aciasydIDme”resu】tedinmaI】yde