CHO-MBLw、CHO-MBLm52、CHO-MBLm54、CHO-MBLm57高表达株筛选及产物生物学特性研究

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1、硕士研究生：赵娜指导老师：陈政良摘要甘露聚糖结合凝集素(mannan．bindinglectin，MBL)是哺乳动物C型凝集素超级家族中胶凝素家族成员，主要由肝细胞分泌，作为糖蛋白存在于血浆中。MBL通过与2个MBL相关丝氨酸蛋白酶(MBLassociatedserineprotease，MASP．1，MASP．2)结合而激活补体凝集素途径，在天然免疫中发挥重要作用。现已发现3个可导致血清(浆)MBL水平低下并进而引起调理吞噬缺损的MBL结构基因点突变：CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA，其编码产物的改变分别是Arg--->Cys、G

2、ly---}Asp及GlyjGlu。这些点突变为常染色体显性遗传，其基因频率在不同种族人群中差异甚大，但总体来说极高，如第52位密码突变在所研究过的人群中相对较低(≤0．1)，第54位密码突变在欧亚人群中有较高频率(0．11~o．14)，而第57位密码突变在撒哈拉非洲人群中的频率很高(O．23~0．29)。显然，MBL缺损是迄今所发现的最常见的遗传性免疫缺损病，而各种病原体的反复感染与MBL缺损密切相关。然而，MBL基因突变引起免疫缺损的机理迄今尚未完全清楚。本课题组曾将相同质量数的野生型和3种突变型MBL真核表达载体用脂质体法分别转染入相同数目的CO

3、S7细胞中，72h后检测各目的蛋白的分泌量。将4种(1种野生型基因转染COS7和3种突变型基因转染COS7)细胞培养上清中检测出的蛋白进行One．wayANOVA分析，发现4种细胞培养上清中目的蛋白的量没有显著性差异(尸>0．05)，由此证明，MBL结构基因点突变并不影响MBL蛋白的合成与分泌。既然MBL结构基因点突变并不影响蛋白的合成与分泌，那是什么原因导致二、野生型和突变型MBL基因转染CHO细胞稳定高效表达株的筛选本课题组前期工作已成功构建含有4种真核表达载体的CHO细胞，即CHO．MBLw、CHO．MBLm52、CHO．MBLm54和CHO．M

4、BLm57。将上述细胞分别复苏后，在96孔板中单克隆化，待细胞克隆长至孔底的1／4后，挑取细胞株置12孔板内培养24h后，以800mg／L的Zeocin加压筛选。随后的1个月中，每隔3～5天换液一次，维持Zeocin浓度为800mg／L。分别得到4、1、2、5株稳定高效单克隆细胞株，ELISA检测上清中目的蛋白浓度均达到1~2mg／L。RT-PCR分析表明，转染4种MBL基因的CHO细胞均稳定转录mRNA。三、野生型和突变型MBL蛋白的纯化及其生物学特性研究利用鼠抗人MBL．CRDmAb亲和层析柱初步纯化表达产物，Ni2+．NTAagarose层析柱进

5、一步纯化表达产物，获得野生型和突变型重组MBL蛋白。在lL培养上清中均获得lmg左右的目的蛋白。经Westernblot和ELISA鉴定，纯Il硕士学位论文化后的蛋白产物可分别与抗MBL—CRD单克隆抗体、抗His单克隆抗体和抗MBL单克隆抗体结合。它们分别命名为野生型MBL蛋白和32Cys、34Asp、37Glu突变型MBL蛋白。通过SDS．PAGE和Westernblot分析，发现重组突变MBL蛋白以双链(Mr约55000)为主，而重组野生型MBL分子则以二至六聚体(Mr150000--450000)为主。结果表明，突变蛋白的多聚化程度远远低于野生

6、型MBL蛋白。酵母菌凝集试验显示：人血浆天然MBL和野生型MBL蛋白能结合酵母菌细胞壁甘露聚糖，产生可见的凝集颗粒，3种突变型MBL蛋白凝集颗粒极少；配体结合实验表明，只有天然MBL和重组野生型MBL蛋白才能与甘露聚糖有效结合，3种突变型MBL蛋白与糖结合的功能低下；补体C4d沉积试验显示，3种突变型MBL蛋白不能通过凝集素途径激活补体系统。综合上述资料及本室蔡学敏博士的MASPs结合试验结果即3种突变型MBL蛋白与MASP．1、MASP．2的结合能力降低，我们认为，CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAAMBL基因点突变引起的氨基酸残基的

7、替换影响了其产物蛋白质的结构，使之不能形成结构亚单位及其寡聚体，进而影响其功能，包括结合配体、MASPs的能力和激活补体凝集素途径的活性。关键词甘露聚糖结合凝集素基因点突变哺乳细胞表达生物学特性免疫缺损IIIlCellLinesofCHO—MBLw,CHO—MBLm52，CHO—MBLm54，CHO—MBLm57andResearchoftheBiologicalCharacteristicsofTheirProductsName：ZhaoNaSupervisor：ChenZhengliangABSTRACTMannan—bindinglectin(M

8、BL)，amemberofthecollectinsuperfamily(C-typelect