在胎儿发育过程中人MK基因的组织差异性表达

《在胎儿发育过程中人MK基因的组织差异性表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第41卷　第1期复旦学报(自然科学版)Vol.41No.12002年2月JournalofFudanUniversity(NaturalScience)Feb.2002　　文章编号:042727104(2002)0120001205X在胎儿发育过程中人MK基因的组织差异性表达林万敏,唐以太,陈献华,郭兰萍,徐　平(复旦大学生命科学学院生理学及生物物理学系,脑研究中心,立人实验室,上海　200433)摘　要:MK是肝素结合因子家族中的一个成员.用RT2PCR研究了第11～16周胎儿龄的胎儿的神经组织与非神经组织中MK基因的组织差异性表达.随着胎儿龄的增加,在神经组织中,MK呈现出

2、规律性的从无到有和从低表达到高表达的趋势,提示它可能在胎儿脑的发育中起着重要的作用.在其他非神经组织中,尽管各组织中MK的表达呈现不同的规律,但看起来总的趋势是趋向活跃.关键词:人MK;RT2PCR;胎儿;基因表达中图分类号:Q132.7文献标识码:A[1]中孕肾因子(Midkine,MK)是发现不久的肝素结合因子家族中的一个成员.MK基因编码一条含143个氨基酸的多肽,其中包含C端长22个氨基酸的信号肽,成熟形式的人MK蛋白长121个氨基酸,分[2]子质量约为14ku.最初,MK是作为一种神经营养因子提出来的,其功能包括促进神经细胞突起生长、[3][4][5][6]促进神经干

3、细胞分化、胚胎神经元的促存活等,后来陆续发现它在肿瘤发生、抑制细胞凋亡、抑[7]2+[8][9]制HIV感染、调控细胞内Ca流、细胞修复等方面也有重要作用.2001年,我室黄建等也在大肠[10]杆菌中获得了人MK的高表达,并初步测定了MK的生物学活性.鉴于MK是一种多功能的细胞因子,而且在动物中孕期,在许多组织中能检测到高表达,我们对它在胎儿发育过程中,尤其在胎儿神经系统发育过程中的表达与功能很感兴趣.目前,这方面的报道很少,也不全,尤其是缺乏MK在各种组织中的比较全面的追踪比较.作为第一步,本文研究了MK在不同胎儿龄的胎儿的主要的神经组织与非神经组织中的差异表达,以说明MK在

4、个体发育过程中时空表达的特异性,为今后的深入研究打下基础.1　材料与方法1.1　实验材料取11,12,16周流产胎儿,在流产后1h内按组织进行分离,存放于-70℃待用.TRIzol试剂kit,购自Gibco公司;DEPC,oligo2dT18,dNTP,RTase,RNaseH等试剂购自上海生工生物工程公司.1.2　实验方法(1)胎儿组织RNA抽提为防止RNA降解,对所使用的水和器皿都用DEPC处理过.RNA抽提基本上按照Gibco公司提供的方法操作:剪取新鲜胎儿组织块约100mg,放在碾钵中碾碎(用液氮将碾钵维持在低温),加入1mLTRI2zol,打匀,移到1.5mL离心管,

5、室温放置5min,再加入0.2mL氯仿,盖紧,剧烈震荡15s,在室温放置5min后离心(4℃,10000r/min,15min);离心后将上层水相转移到1.5mL离心管,在管内加入0.5mL异丙醇,在室温中放置10min后再离心(4℃,10000r/min,10min);离心后弃上清,在沉淀物中加入75%(体积分数)乙醇1mL,重悬沉淀,然后离心(4℃,6000r/min,5min);最后将RNA沉淀物在37℃干燥5min,再用25μLDEPC处理过的ddH2O溶解RNA,取1μL用于电泳检测RNA是否降解.确认X收稿日期:2001205210作者简介:林万敏(1945—),男

6、,副教授;唐以太(1976—),男,硕士研究生.2复旦学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第41卷RNA未降解后,即可进行逆转录.(2)逆转录(reversetranscription)取下列成分混匀于500μL离心管中:5μL总RNA(约1～5μg);0.5μLoligo2dT18(约20pmol/μL);0.5μLRNasin(约40U/μL);6.5μLDEPC处理过的ddH2O(总体积12.5μL).然后使RNA变性(70℃,10min,冰浴1min),再加入5μL第一链buffer(5×),4μLdNTPmix(2.5mmol/L,pH7.0),2.5μ

7、LDTT(0.1mol/L),总体积为24μL;将反应物在37℃预热2min后加入1μLSuperscriptIIRTase(200U),混匀后在37℃反应50min;然后在70℃放置15min终止反应,再加入1μLRNaseH(2U)在37℃保温20min,所得到的cDNA保存于-20℃待用.(3)PCR(polymerasechainreaction)①人MK基因的PCR根据GenBank数据库里的人MKcDNA序列,设计一对引物P1和P2.引物序列:P1为5′2TTTGCGGCCGCA