家蚕RNA剪接分析与真核生物内含子识别机制研究

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1、密级中国科学院大学UniversityofChineseAcademyofSciences博士学位论文作者姓名：指导教师：学位类别：学科专业：培养单位：2013年5月Alternativesplicingandtrans-splicingeventsrevealedbyanalysisoftheBombyxmoritranscriptomeandaPrp5--bridgedU1-——U2snRNPinteractionnetworkduringintrondefinitionByWeiShaoA

2、DissertationSubmittedtoUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofDoctorofPhilosophyinZoologyInstituteofPlantPhysiologyandEcology,ShanghaiInstitutesforBiologicalScience，CASMay,2013家蚕RNA剪接分析与真核生物内含子识别机制研究摘要真核

3、生物基因中存在大量的非编码的内含子序列，它们的去除由RNA剪接完成。RNA剪接是基因表达过程中的一个重要步骤。内含子识别机制决定了RNA剪接的精确性。另外，选择性剪接的发生极大地提高了蛋白质多样性和基因表达复杂程度，在生命活动中具有重要的调控作用。反式剪接是一种特殊的剪接方式，可以将来自两个转录本的外显子剪接到一起，从而综合了两个基因的信息，但在高等真核生物中报道较少。本论文利用不同的模式生物，进行了剪接事件鉴定和内含子识别机制两个方面的研究工作。论文的第一部分内容从家蚕的转录组高通量测序出发，

4、发现并证实了大量的选择性剪接事例和反式剪接事件，为家蚕的进一步深入研究打下了基础。第二部分内容以酵母为材料，通过一系列的分子、生化和遗传学的实验，详细阐述了预剪接体中以ATP水解酶Prp5为核心的蛋白质相互作用网络，并证明了这些蛋白间相互作用在RNA剪接位点的正确选择及内含子定义中至关重要，为进一步探索RNA剪接机制和Prp5功能打下了基础。本论文具体包括以下两部分内容：第一部分：家蚕中选择性剪接与反式剪接研究家蚕(Bombyxmori)是重要的经济昆虫，同时也是研究相对比较完善的鳞翅目昆虫模式

5、系统。但是，目前为止家蚕中的选择性剪接和反式剪接还未被系统地研究过。本论文通过高通量测序对家蚕转录组进行分析，发现了近2000个选择性剪接事件和58个反式剪接事件，并系统地研究了家蚕中的一类RNA剪接调控因子一sR蛋白。本研究发现：(1)家蚕中选择性剪接可以分为5类，分别是内含子包含；外显子跳读；不同5’剪接位点选择；不同3’剪接位点选择和互斥型剪接。(2)家蚕中共有37种SR蛋白。对其中三种SR蛋白剪接产物的深入研究发现了它们的选择性剪接方式和蛋白产物在家蚕、果蝇、线虫乃至人类中是高度保守的。

6、其中Srsf6这个SR蛋白的一种剪接形式在家蚕生殖腺存在性别特异性表达，说明Srsf6可能在家蚕性别发育中具有重要作用，为家蚕性别决定研究提供了新的思路。(3)家蚕中发现的58个反式剪接事件可以分为两类。一类是与果蝇同源的家蚕mod(md94)基因的46种反式剪接。它通过共同的5’上游外显子和分布在500kb范围内正反义链上的46个3’下游外显子发生反式剪接，形成多种有功能的蛋白。进一步研究发现家蚕mod(md94)的多个反式剪接产物具有组织和发育时期表达特异性。第二类包括12个家蚕特有的反式剪

7、接事件。为了确认这些反式剪接事件的正确性，排除RT-PCR造成的假阳性，本研究检测了家蚕品系菁松(Js)和兰IO(LIO)的SNP在F1代中的交换情况，并进一步用等位基因特异性PCR进行了验证。家蚕中反式剪接的验证说明高等生物中可能也存在较多的反式剪接事件，为进一步研究反式剪接打下了基础。(4)同时，本研究还鉴定了320个家蚕新基因，修正了1140个基因模型，为家蚕进一步深入研究打下了基础。第二部分：Prp5调控内含子识别机制研究RNA剪接是通过剪接体(splieeosome)催化完成的。剪接体

8、的组装是一个多步骤的RNA-蛋白质复合物构象形成和变化的过程，需要一类具有ATP水解酶活性的DExD／Hbox蛋白家族的催化。在预剪接体(pre．spliceosome)组装的过程中，剪接体需要精确地识别内含子和外显子，从而促进剪接精确而高效地进行。预剪接体的组装包括U1snRNP和U2snRNP分别对5’剪接位点及剪接支点区域的识别。同时，U1．U2snRNP间相互作用是内含子识别和定义的关键步骤。虽然目前对U1snRNP及U2RNP组分研究已经比较清楚，但是对于其蛋白质问相互作用还知之甚少。