SDS-聚丙烯酰胺垂直平板电泳

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1、SDS—聚丙烯酰胺垂直平板电泳一实验原理十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂。由于SDS分子本身带有负电荷，能够与蛋白质的疏水区相结合，使蛋白质伸展和解离，从而使蛋白质呈一致的强负电荷。当采用加SDS的聚丙烯酰胺进行电泳时，利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应，可以进行蛋白质分子量的测定。在用该方法进行分子量的测定中，是利用某些已知分子量的指示蛋白质与经SDS处理后解离成单链的蛋白质样品进行电泳比较，根据蛋白质的电泳迁移率，在一定的分子量范围内与分子量的对数所呈的线形关系，就可以测出单链样品蛋白质的分子量。用该方法测得的是蛋白质亚基的分子量。SDS—聚丙烯酰胺

2、凝胶电泳可以采用园盘电泳的形式，也可以采用垂直平板电泳的形式，其原理相同，操作步骤也大致相同。另外SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳亦分为不连续系统和连续系统。本实验采用垂直平板以不连续系统的SDS—聚丙烯酰胺凝胶方式进行电泳。垂直平板电泳的优点在于在一块凝胶平板上可以同时进行不同样品的电泳。因此条件一致，更加便于比较。二实验目的与要求（1）、学习与了解SDS—聚丙烯酰胺垂直平板电泳的方法（2）、通过对某一蛋白质样品的分子量测定，了解和掌握该方法的分子量测定技术。三实验仪器与器材3-1、实验仪器：（1）、垂直平板电泳槽装置（套）；（2）、电动磁力搅拌器（3）、电动脱色

3、仪（4）、电泳仪（5）、电炉（6）、天平（7）、混合器3-2、主要实验器材（1）、可调取液器（2）、微量注射器（3）、医用注射器（4）、8#针头（5）、烧杯（6）、洗耳球（7）、量筒（8）、培养皿（9）、吸水纸（10）、记号笔四实验试剂与配制4-1、实验试剂（1）、丙烯酰胺（Acr）（2）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）（3）、过硫酸铵（AP）（4）、四甲基乙二胺（TEMED）（5）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）（6）、考马斯亮兰G-25（7）、十二烷基硫酸钠（SDS）（8）、2—巯基乙醇(EtSH)（9）、甘氨酸（gly）（10）、溴酚兰（11）、甘油（12）、盐

4、酸（13）、琼脂糖（14）、甲醇（15）、冰醋酸（16）、牛血清白蛋白（BSA）；MW：66,200道尔顿（17）、鸡蛋白蛋白（CEA）；MW：42,000道尔顿（18）、低分子量标准指示蛋白：分子量范围10000—100,000兔磷酸化酶-B；RabbitPhosphorylaseb；MW：97,400道尔顿牛血清白蛋白；BovineSerumAlbumin；MW：66,200道尔顿兔肌动蛋白；RabbitActin；MW：43,000道尔顿牛碳酸酐酶BovineCarbonicAnhydrase；MW：31,000道尔顿胰蛋白酶抑制剂；TrypsinInh

5、ibitor；MW：20,100道尔顿鸡蛋清溶菌酶；HenEggWhiteLysozymeMW：14,400道尔顿4-2、试剂配制（1）、电极缓冲液的配制：（2）、丙烯酰胺(Arc)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)溶液的配制：（3）、10%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液的配制：（4）、10%过硫酸铵(AP)溶液的配制：（5）、pH8.8；1.5mol/L三羟甲基氨基甲烷—HC1Buffer的配制（6）、pH6.8；1.0mol/LTris—HC1Buffer的配制：（7）、四甲基乙二胺(TEMED)，直接取原液。（8）、2%琼脂糖溶液的配制：（用于封电泳槽渗漏）（9）

6、、0.05%溴酚兰溶液的配制：（10）、样品溶液的配制：0.5mg/1.0ml（11）、标准品溶液的配制:（12）、染色液的配制：（13）、样品溶解Buffer溶液的配制1MTris—HC1pH6.80.5ml甘油0.8ml10%SDS1.6ml2—巯基乙醇（EtSH）0.4ml0.05%溴酚兰0.2ml蒸馏水（DDW）4.5ml∑8.0ml需要同学自己配制的试剂溶液（14）、脱色液的配制：，400-500毫升/组冰醋酸：甲醇：水=7.5：5.0：87.5(V/V)五方法与步骤五方法与步骤(一)、凝胶的聚合1、垂直平板电泳槽的装配2、分离胶及浓缩胶的配制3、

7、分离胶的制备4、堆集胶的制备(二)、加标准品和样品溶液1、加样量2、加样方法(三)、电泳(四)、处理凝胶区带1、染色2、脱色(五)、鉴定5-1、凝胶的聚合5-1-1、垂直平板电泳槽的装配（1）、在洁净的电泳槽和玻璃平板两边缘中间各添加一块小垫条，紧紧贴合四只夹子（一边二只），以致密封。（2）、用滴管吸取经沸水加热溶解的2%琼脂糖溶液，趁热灌注于玻璃平板的底槽，待琼脂糖凝固后，底层即封闭（需避免气泡）。（3）、再在玻璃平板槽内用注射器（或滴管）加蒸馏水至满刻度，并观察是否有渗漏现象如有渗漏，则需要重新安装玻璃平板槽，应确保无渗漏，然后弃去槽内蒸馏水,并用吸水纸轻

8、轻吸去槽内未弃尽的蒸馏水。5-1-2、