SDS-聚丙烯酰胺凝胶

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1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳一.什么是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳?1.聚丙烯酰胺凝胶:由丙烯酰胺单体(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素,以及加速剂四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成的三维网状结构凝胶.形成的凝胶具有稳定的亲水性,无电离基团,不带电荷,几乎无吸附和电渗作用.凝胶孔径可控制.*凝胶机械性能和孔径大小:由总浓度T%控制.即100ml凝胶溶液中含有Acr、Bis的总克数.T%越大,平均孔径越小,机械强度大.交联度C%:Acr和Bis的比例.即交联剂Bis占单体Acr与Bis总量的百分数.*分子量范围适用的凝

2、胶浓度(%)蛋白质10420-301-4×10415-201-5×104-1×10510-151×1055-105×1052-5核酸10415–20104–1055-10105-2×1062-2.62.SDS:十二烷基磺硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,SDS)阴离子去污剂在水溶液中以单体（monomer）和分子团（micellae）的混合形式存在.破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性(denature)而改变原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物

3、,电泳系统中加入一定浓度的SDS称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE).SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于蛋白质的分离、蛋白质或肽类分子量的测定.二.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理:SDS与样品中各蛋白质形成的SDS-蛋白质复合物带有大量的负电荷,从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低或减至最小,与此同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致使被测物的泳动速率的大小完全取决与该物质的分子量.(一)蛋白质分子的解聚样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,而电荷因素可以被忽略。1.SD

4、S阴离子去污剂,变性剂,助溶剂.断裂分子内和分子间的氢键,分子去折叠,破坏蛋白质分子的二级和三级结构.2.强还原剂a.β-巯基乙醇b.二硫苏糖醇(DTT)使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂.SDS和还原剂的作用：（1）分子被解聚（2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。（3）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异蛋白质-SDS胶束的特点（1）形状像一个长椭圆棒（2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的.（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比.胶束在SDS-PAGE系统

5、中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD—200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系.*不同的蛋白质分子有不同的电泳迁移率mR，自由迁移率m0和阻滞系数KR值不同蛋白质的SDS复合物的m0值都很接近，分子量相差5倍的蛋白质之间，m0值只相差10%，如果忽略这个差别,就可以认为，各种蛋白质-SDS复合物的m0基本上是一个定值。这表明，不同蛋白质的SDS复合物都带有相同密度的负电荷，并具有同样的构象它们的净电荷量与摩擦系数(f由溶液的粘滞性、蛋白质分子的大小和形状决定)之

6、比（q/f）都接近于一个定值而不受各种蛋白质原来电荷、分子大小和形状的影响，因而，在溶液中，自由迁移率就表现出一致性；但在一定浓度的凝胶中，由于引入凝胶的分子筛效应，电泳迁移率mR就成为蛋白质分子量函数.3.影响SDS电泳的关键因素(1)溶液中SDS单体浓度（>1mmol/L)大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1：1.4(2)样品缓冲液的离子强度（不>0.26)低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。（3）二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，蛋白质分子才能被解聚,SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构

7、象而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。（二）缓冲系统的选择一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的。电泳缓冲液的种类：1.磷酸缓冲液2.Tris-醋酸钠缓冲系统3.咪唑缓冲液系统：比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速度比后者快一倍.4.尿素系统：适用分子量低于15KD的蛋白样品.5.Tris-甘氨酸系统：使用最多的缓冲液6.Tris-硼酸盐缓冲液：测定糖蛋白的分子量（三）凝胶浓度的选择由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS-蛋

8、白质胶束的大小，因此凝胶