氟化物对骨形成中成骨细胞影响的实验研究

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1、中国医科大学博士学位论文氟化物对骨形成中成骨细胞影响的实验研究姓名：张颖申请学位级别：博士专业：劳动卫生与环境卫生学指导教师：孙贵范2003.4.1中文摘要目的我国是地方性氟中毒发生率较高的大国，出于氟的过量摄人导致的氟骨症困扰了许多患者。目前人们对于氟的骨相损伤机制尚不完全清楚。成骨细胞作为骨组织中重要的功能细胞，在骨的形成过程中起着关键作用。本研究目的在于建立体外大鼠(乳鼠)颅骨成骨细胞分离培养体系及鉴定技术，排除体内多种调控因素的相互影响，从单细胞的形态和代谢指标的变化，观察氟化物对体外培养的成骨细胞的直接效应，探讨

2、不同浓度氟化物对成骨细胞是否具有促进增殖和分化作用，从而在细胞水平了解氟化物对骨形成过程的作用；通过体内、外实验研究氟化物对成骨细胞结构、细胞周期和细胞凋亡的影响，为进一步探讨氟致骨骼损伤的机制提供基础资料；通过检测氟化物对成骨细胞的DNA损伤，探讨成骨细胞对氟化物的基因毒性反应，为全面评价氟毒性提供科学依据。方法1．大鼠颅骨成骨细胞分离培养纯化体系及鉴定技术的建立：生后2天的Wistar乳鼠脱颈处死后，无菌取颅盖骨放入盛有缓冲液的培养皿中，尽量去除骨膜和周围结缔组织。加入0．25％胰蛋白酶液，37。C恒温消化20min。

3、再用lmg／111lⅡ型胶原酶溶液，37℃恒温消化90min，使细胞从骨基质中解离出来。将上述含分离细胞及骨片的消化液移于离心管中离心，去上清，加入含15％胎牛血清的199培养液，反复吹打成单细胞悬液，以1X105／ml加入培养瓶，置于37℃、5％C02培养箱中培养，隔天换液。应用差速黏附法纯化成骨细胞。l型胶原免疫组化方法鉴定成骨细胞。2．成骨细胞增殖、分化指标的测定成骨细胞以5x104／ml接种至96孔板，24小时后换为无血清199培养液，次13加入不同浓度(0、0．01、0．05、0．1、0．5、l、2,4mmol／

4、L)的氟化钠继续培养24、48、72h，采用AlamarBlue摄入法检测细胞增殖；Elisa方法测定碱性磷酸酶活性。3．成骨细胞周期和细胞凋亡的检测成骨细胞以1X105／ml接种至25ml培养瓶，在含15％胎牛血清的199培养液中培养3天。换为无血清199培养液，24小时后加入终浓度为(0、l、2、3、4mmol／L)的氟化钠，继续培养24小时。用0．25％胰酶消化各组细胞，PBS洗2次，加入配制好的PI染液37。C孵育30分钟，用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。4．细胞DNA损伤检测成骨细胞以IX105／ml接种于6

5、孔板，待细胞融合后，换为元血清199培养液中培养24小时。加入终浓度为0．0．5、1、2、3mmol／L氟化钠作用24小时。经胰蛋白酶消化，离心弃上清，PBS冲洗2次，计数并调整使各剂量组细胞悬液中细胞数为1．0×106／ml。用单细胞凝胶电泳(彗星实验)方法检测DNA损伤。5．动物实验雌性Wistar大鼠40只随机分成4组：A组(对照组)大鼠饲正常饲料，饮蒸馏水；B组饮用蒸馏水含氟化钠50mg／L；C组饮用蒸馏水含氟化钠】00mg／L；D组饮用蒸馏水含氟化钠150mg／L。大鼠自由进食水，60天后全部雌鼠与20只雄鼠按2

6、：1进行交配。所生仔鼠颅盖骨进行光镜、电镜观察；提取仔鼠颅骨成骨细胞，观察细胞超微结构，检测细胞周期与细胞凋亡的变化。6．数据处理用EXCEL、SPSSl0．0进行实验数据的统计分析。结果1．原代成骨细胞培养结果：(1)相差显微镜观察分离的成骨细胞在培养24h后，活细胞贴壁生长。贴壁生长的细胞呈梭形、三角形或多角形等。成骨细胞在单层铺满培养瓶后可出现重叠生长，其中心部细胞密集并可发生钙化，形成肉眼可见的散在白色点状物。(2)I型胶原免疫组化鉴定·2·成骨细胞的胞浆内和细胞间质中分布有棕黄色颗粒，为成骨细胞所分泌的I型胶原，

7、胞核空染，为阳性结果。2．不同浓度的氟化钠对成骨细胞增殖、分化的影响低浓度氟化钠(100p,mol／L～1mmol／L)，72h在体外可刺激细胞增殖；高浓度氟化钠(2mmol／L以上)可抑制细胞增殖；Na．F浓度10p,mol／L～50p,mol／L，4d增强细胞AIjP活力；1001a,mol／L以上的NaF降低了细胞ALP活力。3．不同浓度的氟化钠对体外培养成骨细胞细胞周期和细胞凋亡的影响NaF浓度为0～2mmol／L、24h对体外培养成骨细胞活性元影响。浓度2mmol／L时，S期细胞数增多，G0／G，期和G2／M期细

8、胞无明显改变。NaF浓度为3、4mmol／L时，抑制了细胞的活性，S期细胞数明显增多，G2／M期细胞明显减少。NaF浓度为2、3、4mmol／L时，凋亡百分率增高。4．不同浓度的氟化钠对体外培养成骨细胞DNA的损伤作用在相同的条件下，用0～3mmoL／L的NaF作用于OB，发现NaF可不同程度的诱导DN