《体外转录与翻译》PPT课件

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1、主讲人:杜珍武E-mail:phdzhw@yahoo.com.cn吉林大学药学院基因工程教研室基因工程GeneticEngineering7/15/20211基因体外转录与翻译invitrotranscription/translation基因工程基因体外转录与翻译一、基因体外转录与翻译的意义二、基因体外转录原理与操作三、基因体外转录应用四、基因体外翻译的原理与操作五、基因体外翻译的应用基因工程基因体外转录与翻译一、基因体外转录与翻译的意义基因工程基因体外转录与翻译一、基因体外转录与翻译的意义费事、费力、工

2、序烦琐？？？体外操作体内操作研究蛋白质、RNA方便需要快速、方便获得蛋白质、RNA基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作1、基因体内转录的过程需要的基本物质：DNA模板启动子、结构基因转录终止子RNA聚合酶四种核糖核酸转录因子基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作1、基因体内转录的过程真核基因转录原核基因转录基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作2、基因体外转录的原理基本的工作原理是以DNA为模板，在转录体系中的一系列转录因子的作用下，经RNA聚合酶合成RNA。基因

3、体外转录体系在1976年由PELHAM和JACKSON建立。体外转录体系逐渐成熟。基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作3、基因体外转录的操作（1）RNA聚合酶（RNAPolymerases）常用的聚合酶为噬菌体来源的RNA聚合酶T7、SP6、T3特异识别模板启动子转录效率比大肠杆菌的聚合酶效率高酶的来源及质量高基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作3、基因体外转录的操作（1）RNA聚合酶（RNAPolymerases）基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作3、基因

4、体外转录的操作（2）线形的DNA模板（linearDNAtemplate）要求：有RNA聚合酶识别的双链启动子，被转录基因。质粒（Plasmids）基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作3、基因体外转录的操作（2）线形的DNA模板（linearDNAtemplate）PCR产物（PCRProducts）基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作3、基因体外转录的操作（2）线形的DNA模板（linearDNAtemplate）寡核苷酸（Oligonucleotides）CDNA基因工程

5、基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作3、基因体外转录的操作（3）基本反应体系基因工程基因体外转录与翻译二、基因体外转录原理与操作3、基因体外转录的操作（４）基本反应分型普通型（ConventionalSynthesis）在一个反应体系内得到的ＲＮＡ量较少，主要由于ＲＮＡ探针制备大规模型（LargeScaleSynthesis）　在一个反应体系内得到的ＲＮＡ量＞１００ｕｇ，一般在２０ｕｌ体系内得到１２０－１８０ｕｇＲＮＡ，主要用于结构与功能的研究．基因工程基因体外转录与翻译三、基因体外转录应用1、制备

6、病毒RNA片段用于证明病毒的侵染性利用长链RT-PCR技术方法扩增出病毒全长cDNA，克隆入带有T7RNA聚合酶启动子质粒，以此cDNA为模板作体外转录，转录产物转染细胞后观察到了典型的病毒病变。从而判定病毒的侵染性基因工程基因体外转录与翻译三、基因体外转录应用2、获得干扰用siRNA基因工程基因体外转录与翻译三、基因体外转录应用3、获得核酶（Ribozyme）核酶(Ribozyme)是一种具有核酸内切酶活性的RNA分子，可特异性地切割靶RNA序列。锤头状核酶发夹状核酶基因工程基因体外转录与翻译三、基因体外

7、转录应用4、获得RNA探针基因工程基因体外转录与翻译四、基因体外翻译的原理与操作1、基因体内翻译的过程基因工程基因体外转录与翻译四、基因体外翻译的原理与操作2、基因体外翻译的原理无细胞蛋白质合成系统是一种以外源mRNA或DNA为模板,通过在细胞抽提物的酶系中补充底物和能源物质来合成蛋白质的体外系统.与传统的体内重组表达系统相比,体外无细胞合成系统具有多种优点,如可表达对细胞有毒害作用或含有非天然氨基酸(如D-氨基酸)的特殊蛋白质,能够直接以PCR产物作为模板同时平行合成多种蛋白质,开展高通量药物筛选和蛋白质

8、组学的研究等.基因工程基因体外转录与翻译四、基因体外翻译的原理与操作3、基因体外翻译系统（1）兔网织红细胞系统RabbitReticulocyteLysate网织红细胞由红细胞分化而来，在体内主要是负责合成大量血红蛋白（90%以上），以及球蛋白。这种未成熟的红细胞本身不带细胞核，但却保留了这种高效翻译各种核酸信息的能力，可减少背景，即使在较低的丰度下也能比较高效地合成产物。根据测定，体外合成外源蛋白的效率接近完整