基因芯片平台的建立及在APL细胞分化研究中的应用

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1、上海第二医科大学博士学位论文基因芯片平台的建立及在APL细胞分化研究中的应用姓名：郑培烝申请学位级别：博士专业：遗传学指导教师：陈竺2003.5.1上海第二医科大学博士论文基因芯片平台的建立及在APL细胞分化研究中的应用中文摘要近年发展起来的基因芯片技术已成为功能基因组学的重要研究工具。为了更好地在转录组水平研究疾病的发病机制，我们建立了eDNA基因芯片技术平台，现在已有12，630个克隆，已知基因有9，436个。在平台的质量上，片内和片间的信号强度的相关系数达到O．95，且芯片的结果与实时定量RT．PCR的结果一致性好，说明我们的平台

2、是稳定的可靠的平台。急性早幼粒细胞性白血病(APL)是M3型急性髓性白血病(AML)，特异性的染色体易位引起RmRot．基因断裂并与其它伙伴基因融合，干扰了维甲酸信号传导通路，使细胞分化停滞在早幼粒细胞阶段，在药理浓度的全反式维甲酸(ATRA)作用下，通过与PML—RARer中RARa部分结合，使融合蛋白的构象发生改变，导致共抑制复合物从PML．RARo,上解离，并进而与共激活复合物结合，解除PML-RARot对分化相关靶基因的转录抑制效应，促进APL细胞的分化。虽然对ATRA的作用机制有了一定了解，但维甲酸通路恢复后如何诱导分化的机制

3、仍不清楚，为了进一步研究维甲酸诱导分化的机制，我们应用eDNA基因芯片技术，结合自组成图(SOM)与成分平面展示等生物信息学手段，分析了药理浓度的ATRA诱导NB4细胞分化不同时相(6h、12h、24h和48h)的基因表达谱。通过对受调变的基因的功能及时相的分析，可以看出ATRA诱导的分化是一个复杂且有序的过程。在分化的早期，细胞开始退出细胞周期，增殖受到抑制，抗凋亡基因上调；泛素-蛋白酶体系统被激活，利于PML-RARa的降解和POD结构的恢复。随着细胞的分化，细胞的杀菌、吞噬和黏附功能逐渐增强，同时促进凋亡的基因上调；利于分化的细胞

4、进入凋亡。在细胞分化过程中，转录因子起了重要作用。我们着重分析了C／EBP家族和bHLH家族的转录因子的变化情况，C／EBPa在ATPA作用后表达略微上升，随着向粒系终末分化表达发生了下降，而C／EBPl3和C／EBPe在ATPA作用后表达持续上升，它们变化的不同与这些C／EBP蛋白行使的功能不同相一致aC／EBP8在ATPA作用后表达下降，与文献报道的在粒系分化时上升不一致，上海第二医科大学博士论文我们推测这可能是由于ATRA效应造成的。bHLH家族成员中的c—mye、OLIG2和HESl是分化的负调控蛋白，它们的下调有助于增殖抑制和

5、细胞分化。BHLHB2是ATRA诱导的基因，它的上调可促进NB4细胞的生长抑制和分化。Idl和Id2在结构上只有螺旋．环．螺旋的结构域，没有碱性结构域，所以不能和DNA结合，可与其它bHLH蛋白形成异二聚体抑制它们的功能。Idl和Id2在ATRA诱导的NB4细胞分化中均是明显上调的基因，我们推测在NB4分化过程中Idl和Id2不是作为分化的抑制蛋白存在，而是与一些促进增殖或抑制分化的bHLH蛋白结合，减弱它们的作用，使细胞向中性粒细胞分化。在APL分化过程中已知有多条信号通路参与，如PKC，JAK／STAT，MAPK和cAMP／PKA途

6、径。我们从多个方面证明钙信号通路与APL细胞的分化密切相关。参与IP3受体信号途径的基因如Gq蛋白、磷脂酶C—D和IP3受体表达上升，位于内质网膜上的钙离子通道Polycystin．2及钙泵SERCA3的上调，位于内质网中的钙储存蛋白钙网蛋白(CALR)和高尔基体中的钙储存蛋白nucleobindin2表达下降，均促进了胞浆钙离子浓度的上升，特别是IP3受体信号途径的基因均在早期就发生了改变，说明胞浆中钙离子浓度的上升是ATRA诱导NB4细胞分化过程中的一个早期反应。已知从内质网释放出来的钙一部分进入线粒体，使线粒体中钙增加。在分化的后

7、期，随着凋亡信号的增强，增加的钙可使线粒体膜电位发生改变，释放细胞色素c，激活caspase成员，促进细胞的凋亡。钙离子还可以通过与一些钙结合蛋白如酪氨酸蛋白激酶2、S100A8、S100A9、细胞生长调节蛋白11和钙蛋白酶l结合参与细胞分化。细胞的分化必然伴随着物质和能量代谢的变化。在ATRA诱导APL细胞分化过程中，细胞对葡萄糖的摄取量减少，对糖的利用从以糖酵解为主向有氧氧化为主转变，氧化磷酸化加强，同时核苷酸的合成降低，促使细胞退出细胞周期，走向分化。综上所述，在药理浓度ATRA作用下，APL细胞中的维甲酸受体通路重新被激活，许多

8、基因的表达发生了变化，这些基因形成了一个复杂且有序的调控网络，最终使细胞走向分化。关键词维甲酸；急性早幼粒细胞性白血病；分化；基因芯片占塑兰三垦型奎堂堡主笙壅——EstablishmentofeDNAmic