铁皮石斛互补脱氧核糖核酸表达文库的构建及分析

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1、铁皮石斛互补脱氧核糖核酸表达文库的构建及分析【关键词】铁皮石斛/化学；,,石斛碱/生物合成；,,基因文库　摘要：【目的】构建铁皮石斛互补脱氧核糖核酸(cDNA)表达文库，为克隆石斛活性成分生物合成相关功能基因的全长奠定基础。【方法】以Trizol一步法从4年生的铁皮石斛中提取总RNA，分离纯化mRNA，LD_PCR(longdistancepolymerasechainreaction)法反转录合成双链cDNA，以λTripIEX2为载体，构建铁皮石斛cDNA文库，文库滴度以每mL含噬菌斑形成单位(pfu)的数目来表示，PCR扩增鉴

2、定插入片段。【结果】成功地构建了铁皮石斛cDNA表达文库，原始文库的噬菌斑滴度为43×105?pfu/mL，总克隆数为31×105，重组率为976%，扩增后文库总滴度为68×109?pfu/mL，对随机挑取的噬菌斑进行PCR鉴定，结果插入片段多分布在05～20?kb之间，绝大部分在12～17?kb左右。【结论】文库质量鉴定结果表明，所构建的铁皮石斛cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。关键词：铁皮石斛/化学；石斛碱/生物合成；基因文库8中药功能基因的研究逐渐成为中药现代化研究的一个热点，因为功能基因和次生代谢

3、酶基因决定了有效成分的结构与功能，是中药现代化的关键环节之一［１］。在植物中药功能基因研究中，与基因组测序和表达序列标记(expressedsequencetag，ESTs)测序相比，药用活性成分生物合成相关基因的研究更受到重视，克隆基因的数量呈上升趋势，预示着天然产物后基因组时代的开启及一些天然产物生产方式的可能变革。人们期望克隆中药有效成分的功能基因，并通过基因工程与化学的有机结合而形成新的基因药物。石斛为名贵中药材，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身等功效。石斛碱是石斛药材中最重要的活性成分之一，也是最早从石斛中分离出

4、来的化合物［2-3］，为分离、克隆石斛碱相关功能基因，本文构建了铁皮石斛互补脱氧核糖核酸(cDNA)表达文库，为克隆全长石斛碱生物合成相关功能基因并进行功能鉴定奠定基础。1材料与方法11材料供试铁皮石斛采自云南大理，由中国科学院华南植物研究所叶秀嶙研究员提供，保种于本实验室。12主要试剂与仪器Trizol试剂酶购自Gibco公司；信使核糖核酸(mRNA)分离纯化试剂盒购自Promega公司；cDNA文库试剂盒购自Clontech公司；SfiI购自Biolabs公司；焦碳酸二乙脂(DEPC)购自上海生工公司(Amresco分装)；其他

5、常规生化试剂均为分析纯。紫外分光光度计为Pharmacia公司的Genequant;聚合酶链反应(PCR)仪为PekingElemer公司的GeneAmpSYSTEMS?9600。13总核糖核酸(RNA)提取及mRNA纯化取4年生新鲜的铁皮石斛，称取其叶片100?mg，经清洗及用体积分数为75%的乙醇消毒后，置研钵中加液氮迅速充分研磨，加2?mLTrizol试剂，余下操作按试剂盒说明进行；提取的总RNA用12?g/L的甲醛琼脂糖变性凝胶电泳分析并鉴定其质量，用100?μLDEPC水溶解储于-80℃8的超低温冰箱中备用；取10?μLR

6、NA用DEPC水稀释50倍后，采用分光光度计测量260?nm/280?nm处的吸光度(D)，计算总RNA的得率，计算公式为：ρRNA=004×稀释倍数×D260采用亲和素顺磁珠(SAPMPS)法从总RNA中分离纯化mRNA。在无RNA酶(RNaesfree)的Eppendorf管中加入01?mg的总RNA和无RNA酶的水至终体积为500?μL，65℃加热10?min，加入3?μL生物素标记的高聚脱氧胸苷酸［Oligo(dT)］和13?μL?20倍的SSC缓冲液于RNA中，其余步骤按说明书及文献［4-5］方法进行。14cDNA的合成及

7、文库的构建采用LongDistancePCR(polymerasechainreaction)法合成cDNA的第1和第2链［4-7］。在05?mL离心管中，加入3?μL铁皮石斛mRNA，按试剂盒方法加入相应试剂及引物，经反转录酶合成第1链cDNA；在1个05?mL的离心管中加入2?μL第1链cDNA，其余试剂按试剂盒要求加入，放入经预热到95℃的PCR仪中。PCR反应程序如下：94℃变性30?s，接着94℃、5?s，68℃、6?min，共26个循环；PCR结束后，取5?μL采用11?g/L琼脂糖凝胶电泳检测。合成的cDNA经蛋白酶K

8、处理去除蛋白质，经氯仿/异戊醇抽提，酒精沉淀后，用限制性内切酶SfiI酶切消化，过CHROMASpin400柱分离纯化，除去分子量小于400?bp的cDNA片段和杂质。将分离的双链cDNA片段按一定浓度与定向克隆到SfiI酶切的去磷酸