基因芯片技术在黄曲霉毒素生物合成相关基因检测中的应用研究

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1、Y029873分类号——UDC密级编号82盟01±Z学位论文基因芯片技术在黄曲霉毒索生物合成相关基因检测中的应用研究．Researchandapplicationsofgenechipondetectinggenesinvolvedinaflatoxinbios2Inthesis指导教师姓名申请学位级别论文提交日期胡娜许杨教授(博士)中德联合研究院工学博士专业名称食品科学2006年5月论文答辩日期2006年6月学位授予单位和日期南昌大学2006年月日答辩委员会主席评阔人2006年6月日南昌大学2003级博士学位论文中文摘要黄陆霉毒素(Aflatoxins，AFT)是最常见的一类真

2、菌毒素，广泛分布于土壤、动植物特别是花生、玉米等人类传统农作物中。因其对人和动物肝脏组织有严重的破坏作用，并可导致肝癌甚至死亡而被世界卫生组织定为I致癌物。本文采用Plackett—Burman(PB)试验筛选出对毒素产量影响显著的生长因子，然后采用响应曲面法研究了各关键因子对寄生曲霉AS3．4407和黄曲霉AS3．4408产毒的影响以及它们间的交互作用，得出菌株产毒量最低和最高时所对应的环境条件，为实践中粮食作物等的AFT污染控制提供理论依据和针对性措施。此外，本实验结合RT—PCR方法成功建立了基因芯片制各技术，搭建了可用于分析黄曲霉毒素生物合成相关基因的生物芯片技术平台，并

3、筛选出与产毒相关的6个差异表达基因，初步分析了差异表达基因与黄曲霉毒素产生的相关性。为高通量筛选真菌中与产真菌毒素相关的基因提供技术支持。主要研究结果如下：1建立了改进的HPLC联合荧光检测器检测黄曲霉毒素的方法。用三倍体积氯仿提取样品中的黄曲霉毒素B1。用HPLC．荧光检测器检测。HPLC的色谱条件为：反相C18柱(250X4．6ram)，流动相为甲醇：乙腈：水(30：20：50，v／v／v)，流速0．8mL／min。该法最低检出限为2ng／mL，AFBl加标量为6．25-1000ng／mL时，发酵液中AFBl的平均回收率为86．4～96．8％，变异系数小于7．0。提取液无需过

4、柱纯化，可以直接进行检测。该方法不但可以将待检毒索与其它杂质有效分离，而且可以同时检测其它三种与AFBl结构非常相似的AFB2、AFGl和AFG2。2通过PB试验确定转速、温度和初始pH三因子对寄生曲霉AS3．4407的毒素产量影响显著(P

5、350ng／mL以上(转速174rpm、温度27．7℃、pH6．0)，而在不适条件下约为200ng／mL(转速240rpm、温度18．O℃、pH8．O)，实验值与预测值之间的相关系数为0．99，证明应用此模型能够很好地预测不同生长环境条件下的产毒情况。南g大学2003级薅士学位论文3通过PB试验确定时间、温度和装液量三因子对黄曲霉爿S3．4408f143毒素产量影响显著(p<0．001)，利用Box．Behnken实验设计建立了黄曲霉产毒预测模型Y=598-46．25x1+33．13x2-25．63x3-124．63xlx2-108．38XlX3—48．37x2x3—47．5x1

6、2-45x22+88．75x32。通过对响应面的分析，得到较高毒素产量(>500ng／mL)的培养条件范围分别为，温度27～29。C，装液量55～65mL／250mL，时间7～10天。通过解二次回归方程，可知在27。C，64．5mL／250mL和培养9天条件下可得到最高毒素产量606ng／mL。预测值和实测值有良好的相关性。4以Genebank中公布的基因序列信息为背景设计了27对引物，通过RT-PCR从高产毒寄生曲霉AS3．4407总RNA中扩增获得与黄盐霉毒素生物合成相关的25个基因片段和一个阳性对照基因片段肛．tublin，从大肠杆菌基因组中扩增得到一个阴性对照基因片段La

7、cZ，将它们作为芯片点阵的探针。为获得一致的杂交温度，设计合成的探针片段长度均为400bp。5建立了比较成熟的可用于分析黄曲霉毒素生物合成相关基因的：西片技术。研究表明芯片点阵后依次通过温浴2h，650mJ／cm2紫外交联30s，80℃烘烤2h，预杂交45min，清洗，干燥等步骤，最后与待测样品在42。C杂交16h，可获得低背景高质量的芯片。初步建立了可用于分析黄曲霉毒素生物合成相关基因的芯片技术平台。6采用诱导产毒培养的方法培养寄生曲霉AS3．4407，获得产毒与不产毒两种性状