离子交换层析柱和填料选择指南

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1、GE医疗中国离子交换层析柱和填料选择指南GE梦想启动未来一般信息样品离子交换层析的原理平衡梯度洗脱洗涤再平衡上样体积高盐洗涤离子交换（IEX）层析能够分离电荷只有轻微差别的1M5CV紧密结合一分子或组分子。以保证分离是基于带电分子与带的分子在不结合的分子在相反电荷的层析填料之间的可逆相互作用。通常情况梯度开始前被洗脱高盐洗涤l]中被洗脱下，选择条件被感兴趣的分子随着上样柱上而结合到Ca[N层析填料然后改变条件以便使被结合的物质被洗脱。10–20CV经常通过连续梯度或逐步增加离子强度进行洗脱，最5–10CV常使用NaCl。图1显示典型的高分辨率梯度洗脱。阶05–1

2、0CV柱体积（CV）段洗脱如图3所示。图1.使用梯度洗脱的典型IEX分离。蛋白质由含有可以被测定的弱酸和弱碱基团（即电离一般信息选择性和缓冲液pH基团）。因此，蛋白质的净表面电荷是高度依赖的p图2显示pH对选择性的影响。三种假定蛋白在不同pHH，并将随着环境pH变化而逐渐改变。每种蛋白质都下的分离如下所述，在图中阐明四种情景（见编号的有其针对pH的独特静电荷关系，这可以被视为滴定箭头）。曲线（图2）。这条曲线反映了蛋白质整体净电荷如何根据环境的pH变化。可以在不同的pH值下利用IEX酸性最强pH：所有三种蛋白都处于它们的等电以分离具有截然不同电荷性质的多种蛋白。

3、图2显示点，带正电荷，且只结合阳离子交换剂。蛋白质按如何选择正确的pH（实现令人满意的分最重要参数照它们的净电荷顺序被洗脱下来。之一）。较小酸性pH：蓝色的蛋白在其等电点以上，带负电荷，而其他蛋白仍然带正电荷。蓝色蛋白结合阴离子交换剂的选择离子交换剂，并可以与直接洗涤穿透的其他蛋白分以强交换剂(Q,S,SP)开始，能够在广泛的pH范围进离。另外，红色和绿色蛋白可以在阳离子交换剂上被行开发工作。如果感兴趣蛋白的等电点低于pH7.0或分离，而蓝色蛋白洗涤穿透。未知，则使用强阴交换剂（Q）结合蛋白。碱性最强pH：所有三种蛋白都高于它们的等电当在一个极端pH下出现最大分

4、辨率，而且感兴趣的点，带负电荷，且只结合阴离子交换剂。蛋白质按蛋白质在此pH下稳定时，使用强交换剂。照它们的净电荷顺序被洗脱。如果强的离子交换剂的选择性不理想，则考虑使用弱较小碱性pH：红色蛋白低于其等电点，带正电的交换剂(DEAE,ANX,CM)，但请记住弱的离子交换剂荷。红色蛋白结合阳离子交换剂，而其他蛋白洗涤的离子交换能力随着pH而变化。穿透。多峰配体(MMC,adhere)提供离子相互作用、氢键和另外，蓝色和绿色蛋白可以在阴离子交换剂上进行分疏水相互作用。MMC表现的如同弱的阳离子交换剂，离，而红色蛋白洗涤穿透。但可以在高电导率下结合。Adhere表现为

5、强阴离子13交换剂。AbsAbsAbsAbsVVVV+层析柱填料选择阳离子根据纯化步骤的目标和起始材料的条件选择离子交换填料。其他因素例如样品稳定性、规模、速度、0pH结合能力和提供的设备也可能影响最后的选择。表面净电荷阴离子–AbsAbsAbsAbsVVVV24图2.pH对选择性的影响（洗脱模式）。样品制备方法开发与优化（按照优先顺序）为了获得最佳的分离并避免层析柱性能的退化，正确通过测试一系列PH值寻找最佳PH，在这些PH值中的样品制备是必要的。样本必须是澄清的，无颗粒物感兴趣的蛋白质是稳定的。如果目标蛋白的等电点已质。知，则以更窄的pH范围开始，例如可以从

6、离等电点为了去除颗粒物质，过滤（过滤器孔径见缓冲液配制）0.5–1pH单位。或离心（10000g，15分钟）样品。脱盐样品使用HiTrap™Desalting5ml（体积达到1.5ml）或HiPrep™如果需要，使用自动化填料搜索程序搜索最佳选26/10Desalting（体积达到15ml）转换为所选择的其择性（测试强或弱的交换剂）。实缓冲液。在高盐浓度下不含主要污染的非常小体积的样品可以用起始缓冲液稀释，以降低盐浓度到不干搜索在选定pH下提供合格分辨率的最陡梯度。扰填料的水平结合。搜索保持分辨率和尽可能减少分离时间的最高流层析柱准备速。检查对于待定填料的推荐流

7、速。在使用任何IEX填料前洗掉保存溶液和防腐剂。搜索可以上样同时维持满意的分辨率的最大上样使用预装层析柱以保证最好的性能分离效果和可重复量。通常，上样20–30%层析柱总结合容量提供采用的结果梯度洗脱的最佳分辨率。所需要的填充床体积是由待纯化样品的量和填料的结合容量决定。装柱，层析柱将具有超过所需要结合容6.对于大规模纯化，通过转变为图3所示的阶段洗脱量大约5倍的结合容量，柱床高度达到20cm。可以减少分离时间和缓冲液消耗。高盐洗涤缓冲液配制1M有关挥发性和非挥发性缓冲系统的建议见表1。目标不要的分子洗脱不结合物质洗脱缓冲离子应该具有与IEX填料上功能基团相同的

8、电荷，分子洗脱l]样品紧