酶膜生物反应器制备核苷酸的研究

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1、浙江工业大学博士学位论文酶膜生物反应器制备核苷酸的研究姓名：石陆娥申请学位级别：博士专业：工业催化指导教师：刘化章;应国清20070401研究了游离酶膜通量衰减曲线，考察了温度、压力等对膜通量的影响，优化了游离酶膜生物反应器的操作条件，并通过单因素及曲面响应法确定了游离酶膜生物反应器制备核苷酸的最佳酶解工艺条件：底物浓度1．25％、锌离子浓度6．0x10～mol／1、底物pH为5．3、加酶量0．080mg／ml、温度为65℃、底物中醋酸缓冲液的浓度0．125mol／1。在最佳条件下制备的核苷酸收率为

2、12．15mg／ml，平均转化率为97．2％。考察了纸纤维为载体的共价偶联法、壳聚糖微球币I]DEAE纤维素为载体的交联法等几种固定黛方法，获得较优的固定化条件。研究了固定化核酸酶P1的酶学性质，与游离酶相比：最适pH提高0．5个单位，耐酸碱性也得到了提高；以壳聚糖微球和纸纤维为载体的固定化酶最适温度提高了10℃，热稳定性、存储稳定性都得到了提高；纸纤维固定化酶、壳聚糖微球固定化酶、DEAE纤维素固定化酶的米氏常数‰分别为5．72、96．58、27．21mg／ml。采用化学交联法和物理吸附法研究了以

3、膜为载体的酶固定化方法，结果表明化学交联法优于物理吸附法。同时考察了上述几种固定化酶在膜生物反应器里的使用稳定性，相比较而言壳聚糖微球固定化酶比较适合，使用十次后残留相对酶活为96％，核苷酸转化率为84％。通过单因素及曲面响应法确定了壳聚糖微球固定化酶在膜生物反应器中制备核苷酸的最佳酶解工艺条件：底物浓度1．57％、锌离子浓度6．OxlO～mol／1、底物pH为5．4、加酶量0．080mg／ml、温度为72℃、底物中醋酸缓冲液的浓度0．125mol／1。在最佳酶解工艺条件下可得到最大核苷酸收率为14

4、．52mg／ml，转化率为92．5％。对酶解产物5’．核苷酸进行了分离纯化，先用阳离子交换树脂IRl20分离出5'-AMP和5’。GMP，再用阴离子交换树脂IRA400分离5’一啪和5’．CMP，考察了一k样量、缓冲液流速、洗脱浓度、离子强度、pH值等因素对5’．核苷酸分离纯化工艺条件的影响，四种核苷酸都得到了很好的分离，回收率在80％以上。关键词：酶膜生物反应器，核苷酸，核酸酶Pl，分离纯化II】浙江工业大学博士学位论文ENZYⅣ【ATICPRODUCTION0F5’0哪CLEOTIDESUSIN

5、GENZY^4EM匝M旧RANEB10REACToRABSTRACT5'-nucleotideshavebeenwidelyusedinpharmaceuticalandfoodindustries．Thestudyofnucleotideshasbeenoneofhotspots．Andmoreandmorenucleotidesareneededinallkindsofindustries．Nowfourmononucleotidesonlycarlbeproducedbyfewfactorie

6、satthesan'letime．Andthepurityof5'-nucleotidsistoolow，aswellastheproductionissmall，whichhasledtotheshortageofrawmaterialandhasrestrainedthedevelopmentof5'-nucleotidesindustry．Enzymemembranebioreactorhasbeendevelopedwit}1theprosperityofbiochemicalenginee

7、ringandmembraneseparationtechniques．Asapracticaluseofthetheoryintegratedbio—reactionseparationprocess，EMBRhasitsoverwhelmingvirtues．EMBRhasbeenwidelyusedinfoodindustry、biochemicalengineering、pharmaceuticsandenvironmentalprocess．Thusstudyoftheproduction

8、of5'-nucleotidesbyenzymatichydrolysisofRNAusingenzymemembranebioreactorhasbeeninvested．PreparationandpurificationofnucleaseP1，preparationof5'-nucleotidesbyfreeandimmobilizedenzymemembranebioreactorandseparationof5’-nucleotideswerestudie