位细胞核转染技术的新进展与应用

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1、NucleofectionAdherentTransfection唐胜伟应用工程师Nov.10th2012主要内容®n核转染技术Nucleofection概述n293细胞需要核转染吗n核转染技术的应用数据库资源®nNEW—原位核转染技术AdherentNucleofectionn总结slide2TMn原理：核转染技术（Nucleofection)是通过施加瞬间电脉冲在细胞膜和核膜上制造小孔,全面的核转染仪器(NuclepfectorTM)程序和细胞类型特异性的转染液相配合开发出的一种解决方案，使核酸底物不仅传递到细胞质，还可以通过核膜进入细胞核。这允许高达9

2、9%的转染效率，并且不依赖细胞的增殖。TMn历史：Nucleofector技术开发于1998年，2001年进入科研市场，是第一个针对原代细胞和难转染细胞系的有效的非病毒转染方法。利用这用技术，原代细胞、干细胞、包括细胞系，可以始终稳定的高效转染。之后，该技术迅速发展起来，并不断创新。原德国Amaxa公司，2008年底成为Lonza科隆分公司。slide3Amaxa简介：4slide4Lonza简介：n1897FoundationofLonzaAGElectricityWorksnLifesciencesdrivencompanynHeadquarteredi

3、nBasel(Switzerland)nSalesofCHF2.9billionin2007nGlobaloperations:n26productionandR&DfacilitiesnEmploysover8’100peoplenGloballeaderincustommanufacturing:nActivepharmaceuticalingredientsbothchemicalandbiologicalnCellTherapynLeadingpositionsinproductmarketniches:nEndotoxindetectionnCel

4、l-basedresearchproductsnNutritionIngredientsnMicrobialControlproductsnPerformanceIntermediatesnTransfectionofprimarycells5slide5核膜—最后的七个纳米普通转染技术核转染技术slide6核转染例证一、共聚焦扫描TMR-DNAGFPDAPIMerge›PrimaryneonatalNHDFcellswerenucleofectedwithlabeledplasmidDNAencodingeGFP,fixedafter2hin3.5%PFA

5、andanalyzedbyconfocalmicroscopy7slide7核转染例证二、开始表达时间ExpressionofeGFP(�)andCD4+TcellsH-2Kk(�)infreshlyisolatedunstimulatedlymphocytesisolatedfromperipheralbloodmononuclearcells8slide8核转染的主要技术特点�底物直接进入细胞核可在数小时内完成整个转染和分析的过程高效非病毒转染原代细胞等难转染细胞�预存已优化程序，操作简单方便�细胞状态好，存活率高�通用各种底物（DNA，RNA等）9sl

6、ide9我只做293细胞，需要核转染技术吗？slide10核转染的其它优势一：高拷贝、高整合频率转染后即刻核均质粒拷贝数标准差(n=3)53231476JohnsonBDetal.(2005)J.Immunother.28,449-46011slide11稳定转染(stabletransfection)Amaxa®Nucleofection®阳离子脂质体12slide12核转染的其它优势二：底物种类无限制、共转无限制Amaxa®Nucleofector®技术可以将DNA、RNA、oligonucleotides、PNA、肽类或蛋白等各种外源底物转入细胞内。转

7、染底物大小不受限制。可以转染270kbBAC。*可以转染14kb的质粒。**可以实现多种底物的共转。****Cellularp32recruitscytomegaloviruskinasepUL97toredistributethenuclearlamina.Marschalletal.J.Biol.Chem.(2005)280:33357-33367.**Efficientnonviralgenedeliveryintoprimarylymphocytesfromratsandmice.Goffinet&KepplerFASEBJ.(2006)20(3):

8、500-502.***FedeleM,etal.Tr