本科生实验指导

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1、实验指导指导老师：习欠云实验十一外源基因在大肠杆菌中的表达实验目的了解IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖）诱导的外源基因在大肠杆菌中的表达的原理，掌握外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测技术。实验原理将外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在大肠杆菌中表达。没有加入IPTG诱导剂的时候，lacⅠ产生的阻遏蛋白与lac操纵子结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，而只有表达载体随大肠杆菌的增殖和复制：当加入IPTG后，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。表达的蛋白可以通过SDS-PAGE（十二烷基

2、硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行初步鉴定。Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolitegeneactivationprotein)因子和cAMP来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与

3、O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。乳糖启动子实验内容材料：大肠杆菌菌株DH5α和BL21以及表达载体PET-32а（+）主要试剂：LB平板（含50μg/ml的卡那霉素），100mMIPTG,10mg/ml的溶菌酶（10mMTris-HCl,pH8.0配制）。Amp（氨苄青霉素）贮存液：用三蒸水配成100mg/ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存。LB液体培养基：10gTrptone,5gYestExtract,10gNaCl,加去离子水定容至1000ml,高压灭菌，冷却后4℃保存。LA液体培养基：10gTrptone

4、,5gYestExtract,10gNaCl,加去离子水定容至1000ml,高压灭菌，待灭菌好的培养基温的度降至60℃左右时，加入Amp至浓度100μg/ml，4℃保存。LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度1.5%（w∕v)，高压灭菌，冷却至约50℃后分装如灭菌平皿中，凝固后4℃保存。LA固体培养基：待灭菌好的LB固体培养基的温度降至60℃左右时，加入Amp至终浓度100μg/ml，摇匀后分装入灭菌平皿中，凝固后4℃保存。50×TAE:750ml去离子水中加入242gTris,57.1ml乙酸，Na2EDTA37.2g,

5、用去离子水定容至1000ml。IPTG（1mol∕L):8ml去离子水溶解2.3831gIPTG后定容至10ml，再用0.22μm滤膜过滤除菌分装入1.5mlEppendenf灭菌离心管中，-20℃保存。实验仪器与设备空气摇床，生化生化陪养箱Eppendenf5804R低温高速离心机EppendenfGentrifuge5410D台式高速离心机EppendenfBiopHotometerMETTLERTOLEDOAB204-E分析天平TS-1脱色摇床超净工作台水浴摇床垂直电泳槽凝胶成像系统操作步骤1大肠杆菌BL-21感受态

6、细胞的制备。2重组质粒pET-32а（+）-actRⅡB转化到大肠杆菌BL-21细胞。3将含有重组表达载体pET-32а（+）-actRⅡB和空表达载体pET-32а(+)的大肠杆菌BL21划线接种在LB平板上，37℃培养过夜，直至平板上生出菌落。4挑取单菌落至5mlLB液体培养基中，培养至OD600=0.6左右，4℃放置过夜。5将LB-PET-32а（+）-actRⅡB菌液接种到3mlLA液体培养基中，37℃，200rpm振摇培养过夜。6取100μL培养过夜的菌液接种到3mlLA液体培养液中，37℃，200rpm振摇培养至OD600至0.6

7、-0.8时，加入1M的IPTG,使IPTG终浓度分别为1mM,置37℃摇床继续诱导培养6h，收集菌体置-20℃保存备用。7另取不含目的基因片段的质粒pET-32а（+）转化BL21感受态细胞做相同处理，加IPTG诱导6h作对照。注意事项1大肠杆菌的表达水平与IPTG浓度、诱导时间、温度以及宿主菌的生长状体有关。当表达量不高时，可以调节IPTG的浓度、诱导时间和温度，甚至重新转化。2菌液的OD值要摇到0.6-0.8，否则会直接影响到蛋白的表达量。思考题1、哪些因素会影响大肠杆菌的表达？2、IPTG诱导蛋白表达原理？实验十二目标蛋白的PAGE

8、检测实验目的了解蛋白质分离纯化及检测方法实验原理不同的蛋白质分子具有不同的电荷和分子量。蛋白质在强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如二巯基乙醇）共同作用下并加热使蛋