银胶浓度8.3修改

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1、银胶浓度对电穿孔法获取细胞内表面增强拉曼光谱的影响俞允基金项目：国家自然科学基金项目（60778046,60910106016），福建省科技项目（2008J0016,2009J01276),卫生部科学研究基金－福建省卫生教育联合攻关计划项目（No.WKJ2008-2-046）作者简介：俞允，男，1985年生，福建师大生物医学光学专业研究生E-mail:yuyunsatan@163.com*通讯联系人E-mail:chenr@fjnu.edu.cn，林居强1，陈荣11.医学光电科学与技术教育部重点实验室，福建省光子技术重点实验室，福建师

2、范大学，福州350007摘要：采用鼻咽癌细胞C666为研究对象，测量六组不同浓度银胶电穿孔后活细胞内表面增强拉曼光谱(SERS)。以光谱强度积分值和光谱重复性为指标，研究银胶浓度对电穿孔法获取细胞内SERS的影响。结果表明：在穿孔脉冲电场强度875V/cm，脉冲持续时间1ms，电穿孔两次的条件下，每500μl电击缓冲液中含有50μl银胶测得的细胞内SERS信号信噪比高且光谱具有较好重复性。银胶浓度增大在增强光谱信号的同时会导致光谱重复性下降。对电穿孔后活性C666细胞内SERS平均光谱进行初步谱峰归属。通过优化银胶浓度，可以提高电穿孔

3、-SERS效果，获取更好的细胞内SERS信号。关键词：表面增强拉曼光谱(SERS)；电穿孔；银胶浓度；C666细胞中图分类号：R282.5,R284.1文献标识码：A文章编号：引言表面增强拉曼光谱（Surface-EnhancedRamanscattering，SERS）具有良好的特异性、选择性以及敏感性，在生物化学分析中起显著作用[1,2]。在对细胞内SERS光谱研究中，往活细胞内引入金或银纳米粒子作为增强基底来获取细胞内表面增强拉曼光谱。当前常用方法是将细胞与金或银纳米粒子充分混合孵育培养，利用细胞内吞作用使金、银纳米子进入细胞来

4、增强拉曼信号，从而测得细胞内SERS信号[3]。此外，生物自体合成金属纳米粒子也被应用在细胞内SERS测量上[4]。可是细胞内吞作用或自体合成金属纳米粒子都需要较长时间，拉曼光谱测量前细胞一般要孵育培养20h以上，而细胞在这一时间内发生的生化变化，可能影响检测结果。因此，研究寻找一种方法使金属纳米粒子快速进入细胞，以实现细胞内SERS光谱及时检测，对细胞等生命组织的研究具有重要意义。基于以上SERS研究的现状，我们首次提出并实现电穿孔-SERS方法，即利用电穿孔技术，在30min内快速将金、银纳米粒子导入活性细胞，并成功测得活细胞内S

5、ERS信号[5]。电穿孔技术是将细胞置于可控电场中，在瞬时高强度电场作用下，细胞膜上出现可逆性的微小孔洞，暂时提高细胞膜通透性，使周围介质中的外源分子更容易进入细胞内【6】。尽管电穿孔技术对于很多大分子而言是很有效的导入技术[6,7]，但是电穿孔导入银纳米粒子过程中使用的银胶浓度对于细胞穿孔后SERS测量结果有很大影响。银胶浓度直接关系到电穿孔导入活细胞内的银纳米粒子数量和聚集程度，浓度过低将导致电穿孔后测不到SERS信号或信噪比差，而过量的银胶容易聚集附着于细胞外，难以清洗干净，对实验准确性造成影响。此外，纳米银生物兼容性不好[8]

6、，大量银胶对细胞生物活性具有杀伤作用。因此，寻求最佳银胶浓度对于提高电穿孔-SERS方法的效果，实现良好的细胞内SERS光谱检测具有重要意义。本文将以人鼻咽癌细胞C666为研究对象，测量六组不同银胶浓度下C666细胞电穿孔后的SERS光谱，研究银胶浓度对于电穿孔法获取细胞内SERS光谱的影响，以获取最佳银胶浓度。1实验器材与方法1.1实验试剂硝酸银（AgNO3）、氢氧化钠（NaOH）、盐酸羟胺（HONH3Cl）均为分析纯化学用品，购自广东化工厂；RPMI1640培养液购自GIBCO；PBS粉购自BOSTER。实验均使用超纯水。1.2实

7、验仪器ECM830电穿孔仪（BTX公司）；电击杯（间距4mm，容量0.8ml，BTX公司）；RenishawinVia型共聚焦显微拉曼光谱仪。1.3银胶制备银胶制备采用盐酸羟胺还原硝酸银方法[9]。将4.5ml氢氧化钠溶液（0.1mol/L）加入到5ml盐酸羟胺溶液（0.06mol/L）中，然后将混合物快速添加到90ml硝酸银溶液（1.1×10-3mol/L）中，加入过程中快速搅拌直至得到均匀乳灰色银胶溶液。室温下避光封存。使用前10000r/min离心10min后弃去上层液获得浓缩银胶。1.4C666细胞培养人鼻咽癌C666细胞株由

8、福建协和医院提供，本实验室培养。C666细胞单层贴壁生长于pH值7.2，含10%小牛血清及双抗（100IU/ml青霉素、链霉素）的RPMI1640培养基中（以下简称RPMI1640完全培养液），于5%CO2、饱和湿度、3