cr引物的设计与实验操作技巧

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1、微生物基因工程李刚副教授教学内容一、PCR引物的设计与实验操作技巧；二、基因组文库的建立与筛选；三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中的应用；四、原核表达系统的选择和高效表达策略；五、真核表达系统的选择和高效表达策略。一、PCR引物的设计与实验操作技巧聚合酶链式反应、分子克隆及DNA序列分析这三大类实验方法几乎构成了现代分子生物学的实验工作的基础。而三者中，PCR方法在理论上出现最早，在实践中应用得最广泛。PCR反应的七种基本成份热稳定DNA聚合酶。一对特异的引导DNA合成的寡核苷酸引物。dNTP（混合液：标准PCR反应包含4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCT

2、P和dGTP。二价阳离子。所有的热稳定DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子，通常是Mg2+用于激活。一价阳离子。标准PCR缓冲液内包含有50mmol/L的KCl，它对于扩增大于500bp的DNA片段是有益的，提高KCl浓度在约70－100mmol/L范围内对改善扩增较短的DNA片段产物是有利的。模板DNA。含有靶序列的模板DNA科研单链或双链形式加入PCR混合液中。闭环DNA模板的扩增效率略低于线性DNA。尽管模板DNA的长短不是PCR扩增的关键因素，但当使用高分子量的DNA（>10kb）作模板时，如用限制性内切酶先行消化（此酶不应切割其中的靶序列），则扩增效果更好。PCR引物设计的几条

3、原则：①引物长度一般引物长度为18-30碱基就足够了。特殊情况下（比如Tm值或GC含量不合适）可以进一步延长到50-60bp长度。但超过60bp的引物长度比较少见。原因一是超过60bp长度的引物比较难以合成，因此合成价格大幅度增加。另外长引物在合成的时候出错率也显著增加。上下游引物的长度应该基本相等，最好相差不要超过3bp。2.碱基组成G＋C含量应在40％到60％之间，4种碱基要在引物中分配均匀。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。3.重复和自身互补序列不能有大于3bp的重复序列或自身互补序列存在。这种序列可形成发夹结构，如果这种结构在PCR

4、条件下稳定，它会非常有效地阻止寡聚核苷酸和靶DNA之间的复性。4．上下游引物的互补性一个引物的3‘端不允许结合到另一个引物的任何位点上。因为在PCR中引物的浓度往往是比较高，所以即使引物间微弱的互补，都会导致引物间形成杂交，随后是引物二聚体的形成和扩增。如果引物二聚体在PCR早期形成，它将和DNA聚合酶、引物及核苷酸竞争进而抑制靶DNA的扩增。精心进行引物设计，应用热启动PCR或降落PCR或特制的DNA聚合酶（如：AmpliGold，Perkin－Elmer）都可以避免引物二聚体的形成。当在一个PCR中应用多对引物时，请注意检查任何一个3’末端都不能和其他任何引物互补。5.解链温度（Tm

5、）解链温度（Tm）：也称熔化温度。计算出来的两个引物的Tm值相差不能大于5C。扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10C。这些特性保证了扩增产物在每个PCR循环可有效地变性。为什么要计算引物的解链温度因为PCR的进行需要确定三个温度。第一，变性温度，变性往往是在94C－95C进行，这是TaqDNA聚合酶进行30个或30个以上PCR循环而活力不致受到过多损失时所耐受的最高温度；第二，退火温度。也称复性温度。复性通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度（Tm值）低3－5C的条件下进行。第三，延伸温度。对TaqDNA聚合酶来说最适温度一般为72C－78C。其中，变性温度和延伸

6、温度对于每个PCR反应来说几乎都是固定的，唯一不同的就是退火温度。而退火温度与引物的解链温度密切相关，因此必须计算出引物的解链温度后才能确定PCR的退火温度。解链温度的计算方法有几个公式可用来计算寡核苷酸与其靶序列形成的杂合分子的熔解温度。但没有一个是尽善尽美的。最常用的两个如下：1、Wallace规则：是一个根据经验确定的简便的计算公式，可用来计算长为15－20个碱基的引物在高离子强度额溶液中（如1MNaCl）形成完全互补配对时的熔解温度：Tm／C＝2（A＋T）＋4（G＋C）。公式中A＋T为核苷酸中A和T残基的数目，G＋C为G和C残基的数目。2、Tm/C=81.5C+16.6(l

7、g[k+])+0.41%([G+C])-(675/n)。该公式能够合理预测一条长度为14－70个核苷酸的引物在小于或等于0.4M的阳离子溶液中的熔解温度。在公式中，n是寡核苷酸引物的碱基数。该公式还可用来计算序列和大小都已知的扩增产物的熔解温度。现在已有一些软件（如PrimerPremium5）可精确计算所设计引物的Tm值。退火温度越高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完