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1、酿酒葡萄种苗（条）热处理脱毒技术研究2002if-第5SINo.ovERsEAsGRAPEvINE&WINE营@嬉酿酒葡萄种苗(务)熬处理膨专技术研究鉴于繁殖材料带病毒是葡萄卷叶病的主要传播途径,在防治上,加强检疫措施和使用无病毒苗木是防治卷叶病最有效的措施.热处理和分生组织尖端人工培养,至今对脱去卷叶病毒(GLRaV)还是较好的方法.1959年Goheen教授创造了芽接热处理方法并取得了很好的热处理脱毒效果,他选用了生长势强,耐高温的LN.33做砧木,将待处理植株的芽嵌接在盆栽砧木的茎部,接种后放置8天,待接口愈合后放置
2、于热处理箱(Heatchamber)内,保持38℃恒温.根据不同病毒对高温的明敏感程度的不同,处理时间有长有短.为寻找简便可靠的脱毒方法,近年来澳大利亚,加拿大,法国等不少国家的科学家们正在进行葡萄茎尖组织培养脱毒的研究,已有关于茎尖培养对GLRaV,Yellowspeckle,Fleck有良好的脱毒效果的报道.热处理和生长点培养相结合是将二者各自的优势融为一体,从而使脱毒效果更为理想.Galzy和Gifford在1961年用热处理和茎尖培养相结合的方法除去了扇叶病毒(GFLV).本实验在研究葡萄茎尖培养和快繁技术的基础上,探索了
3、热处理和生长点培养相结合脱除植株体内病毒的效果,顾沛雯,张军翔(宁夏农学院农学系,永宁750105)为葡萄脱毒技术提供一条重要途径.1材料与方法1.1材料1.1.1植物材料供试材料来源于宁夏西夏王葡萄有限公司酿酒葡萄品种园带毒种条(苗).1.1.2抗血清葡萄卷叶伴随病毒III(GLRaV—III)的CP抗血清和HRP—IgG由中国科学院微生物研究所蔡文启老师赠送.1.1.3辣根过氧化物酶标羊抗兔和邻苯二胺由西北农林科技大学植保系吴云锋老师赠送.1.1.4DG一250型酶联仪宁夏林业研究所提供.1.2方法1-2.1微茎尖培养取无菌苗
4、在双目解剖镜下切取0.3～0.5mm,0.8mm茎尖,在筛选适宜的培养基上培养,形成完整植株.1.2.2热处理材料茎尖培养春季将萌发的盆栽的带毒葡萄苗放置于自制热处理箱中,保持箱内相对湿度70%～80%.经过恒温热处理(38℃)30天和变温热处理(白天38℃,夜晚32℃),经过60天后切取新梢,剥取1.0～1.5mm微茎尖在筛选好的培养基上培养,形成完整植株.1-2_3试管苗热处理将生根试管苗放在LRH一250一G型光照培养箱中,先预热处理(32~C)7天,然后将温度升至38℃,热处理20天,30天,40天后,剥取1～1.5mm茎
5、尖培养.1.2.4组培苗的病毒检测采用间接ELISA检测.参照Lommel等的方法并加以改进.葡萄样品加样本缓冲液(1:1w/V)研磨,5000rpm离心7～8分钟,取上清液待用.测定时用包被缓冲液稀释成1/10浓度,加入酶联板,4℃冰箱中过夜.GLRaV兔抗血清的工作浓度为1:2000,辣根过氧化物酶标羊抗免的工作浓度为1:500.HRP的反应底物为0.04%磷苯二胺和0.15%的过氧化氢配在0.01M柠檬酸一磷酸(pH5.4)缓冲液中.加入酶联板后,室温避光放置10～20分钟,每~L)JH50~L2MH,SO(D液)终止反应,
6、用酶联免疫检测仪DG一25o~,1定OD490值,以待测样品与阴性对照的OD490比值(P/N)≥2.0确定为阳性反应.2结果与分析2.1茎尖大小与脱毒率的关系由表1结果表明,当切取茎尖长度为0.3～0.5mm时,小株存活率为20.9%～54.9%,GLRaV的脱毒率为83.3%～86.4%;当切取瞳2002fr-第5茎尖在O.8mm以上时,存活率为68.6%～78.7%,GLRaV的脱毒率仅为59.5%～70.8%,随着茎尖长度的减小成活率降低而脱毒率升高.同时还表明不同品种间葡萄茎尖的存活率有较大的差异,培养相同茎尖长度(O.
7、3～O.5mm)的茎尖时,"琼瑶浆"的存活率为54.9%,而"西拉"和"白玉霓"的存活率仅为20.9%:~128.2%,脱毒效果品种间差异不甚明显(表1).2.2热处理材料进行茎尖培养的脱毒效果表2结果表明,恒温热处理后切取的茎尖接种64个,成活22个,其中无GLRaV的茎尖21个,分离培养成活率和脱毒率分别为34.4%3195.5%.接种变温热处理的茎尖为62个,成活29个,其中无GLRaV的茎尖27个,分离培养成活率和脱毒率分别为46.8%和93.1%.此外变温热处理的成活率比恒温热处理的成活率提高了12.4%,而脱毒率相差不
8、大.热处理后进行茎尖培养与单纯茎尖培养(O.3～0.5mm)成活率和脱毒率平均增991:10.9%和9.2%.2.3试管苗进行热处理的脱毒效果梅鹿辄试管苗进行热处理脱毒结果表明:热处理2O～3O天的试管苗长势旺盛,取其茎尖容易培养成活,成活率平均达
