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1、动物细胞培养技术研究概述[摘要]动物细胞培养是生物、生物医学研究和应用中广泛采用的技术方法,可分为原代和传代培养,有贴壁、悬浮和固定化培养等培养方式。细胞生长具有特殊的生物学性质,需要无菌、恒温和充分的营养环境.动物细胞培养技术在拥有广阔的发展空间和光明前景的同时也面临着诸多问题和挑战。[关键词]细胞培养;微载体;中空纤维;微囊法培养一、动物细胞培养的发展动物细胞体外培养最早可追溯到1907年,由美国生物学家Harrison在无菌条件下,以淋巴液为培养基成功地在试管中培养了蛙胚神经组织达数周,创立了体
2、外组织培养法。此后,随着抗生素、培养基、培养装置以及工艺方法的不断改进,动物细胞培养(Animalcellculture)的研究和应用逐步增多和深入,发展至今已成为在生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法。其发展简史见下表：动物细胞培养技术的发展[1]年份技术发展概要1907年Harrison创立体外组织培养法。1951年Earle等开发了能促进动物细胞体外培养的培养基。1957年Gcaff用灌注培养法创造了悬浮细胞培养史上绝无仅有的1×1010～2×1010cells/L的记录,标志着现代灌注概念
3、的诞生。1962年Capstile成功地大规模悬浮培养小鼠肾细胞(BHK),标志着动物细胞大规模培养技术的起步。1967年VanWbezel用DEAE-SephardiA50为载体培养动物细胞获得成功。1975年Sarto等在培养基中用激素代替血清使垂体细胞株GH3在无血清介质中生长获得成功,预示着无血清培养技术的诱人前景。预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。1986年DemoBiotech公司首次用微囊化技术大规模培养杂交瘤细胞生产单抗获得成功。1989年Constantinople首次提出大规模细胞培养过
4、程中的生理状态控制,更新了传统细胞培养工艺中优化控制之理论。二、动物细胞培养的概念及生物学特性（一）动物细胞培养的基本概念细胞培养是指从体内组织取出组织细胞并模拟体其内生存环境,在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下,使其生长繁殖并维持结构和功能的一种培养技术。从体内取出细胞首次培养即为原代培养(PrimaryCulture),这是细胞培养的最初和必经阶段.当原代培养细胞生长到一定时期,受到群体环境限制,就需要转移到另一容器才能继续生长,称为传代或继代培养(Subculture)。根据原代培物性状的
5、一致性与否,传代成功后称为细胞系(Cellline)或细胞株(CellStrain)。这些细胞一般可顺利传40～50代次,并保持染色体二倍体数量和接触抑制,传至50代左右时则出现生长停滞,大部分衰老死亡,此类称为有限细胞系/株;在细胞传代的过程中,有些因发生遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞称为无限细胞系/株[2]。（一）动物细胞培养的生物学特性动物细胞无细胞壁,机械强度低,对剪切力敏感,适应环境能力差;倍增时间长,生长缓慢,易受微生物污染;对生长环境和培养环境要求苛刻。1.细胞生命周期性变化[3]体
6、外培养的细胞从适应环境、旺盛生长到由于自身和环境限制缓慢或停滞生长经历一个周期变化。（1）、潜伏期(Latentphase)细胞从接种到适应新环境生长繁殖的一段时间,此间细胞胞质回缩,代谢缓慢.（2）、指数生长期(Logarithmicphase)指数生长期是细胞活力最好的时期,细胞增殖旺盛.在接种细胞数量适宜的情况下,指数生长期持续3～5ｄ后,随细胞数量不断增多,生长空间日趋减少,营养环境恶化,呈现接触抑制(Contactinhibition)。恶性细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生
7、密度抑制(Densityinhibition)。（3）、稳定期(Stagnatephase)细胞数量达到饱和密度后,细胞与营养液的交换面积减少,代谢产物积累,ｐＨ值下降,细胞停止增殖,进入停滞期.营养环境继续恶化后,细胞受损直至死亡。2.细胞培养环境和生长条件（1）、无菌无毒环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件.在体外培养的细胞,由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物质污染,或者自身代谢物质积累,就可能会导致细胞中毒死亡。因此,在体外培养细胞时,应及时清
8、除细胞代谢产物,以保持细胞生存环境无菌无毒。（2）、恒温要维持培养的细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度.偏离适当的温度范围,细胞会受到损伤,影响正常代谢甚至死亡。（3）、气体环境气体主要是O2和CO2，O2可以给细胞提供能量，而CO2不仅是细胞增殖所需的物质，也是其自身的代谢产物，此外，CO2还有着调节培养基pH的作用。（4）、缓冲环境缓冲环境的作用是为细胞提供一个酸碱度在培养细胞生理范围内的培养液，提供水分和无机盐，维持细胞的正常代谢。（5）、培养基培
