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1、无能T淋巴细胞的建立及其免疫生物学特性的研究=摘要>目的探讨体外诱导T淋巴细胞无能的条件,并分析无能T淋巴细胞的免疫生物学特性。方法以Wistar大鼠的脾细胞为刺激细胞,SD大鼠的脾细胞为反应细胞,进行混合淋巴细胞反应(MLR),分别单独或联合加入剂量不等的抗B721单克隆抗体(抗B721单抗)、抗B722单克隆抗体(抗B722单抗),制备无能T淋巴细胞。将无能T淋巴细胞和刺激细胞混合,分别加入抗CD3单克隆抗体、刀豆蛋白(ConA)及白细胞介2(IL22),分析各种情况下无能T淋巴细胞的增殖情况;将刺激细胞与同种异体SD大鼠脾细
2、胞混合,分别加入不同数量的无能T淋巴细胞,分析SD大鼠淋巴细胞的增殖情况。结果单独应用抗B721单抗或抗B722单抗,对淋巴细胞增殖的抑制作用不明显,而将二者联用,能明显阻断T淋巴细胞增殖;ConA及IL22能使无能T淋巴细胞增殖,而抗CD3单克隆抗体不能使无能T淋巴细胞发生增殖;无能T淋巴细胞对同种异体T淋巴细胞的增殖也产生抑制作用,该效应具有抗原特异性。结论联合抗B721单抗和抗B722单抗可诱导T淋巴细胞无能;无能T淋巴细胞在体外呈免疫无反应性,并能抑制同种异体T淋巴细胞的增殖,该抑制作用具有抗原特异性。=关键词>免疫耐受;
3、抗体,单克隆;表位;T淋巴细胞;淋巴细胞培养试验,混合T淋巴细胞是介导排斥反应的主要淋巴细胞[1],它的激活、分化和增殖在免疫应答中起关键作用,因此,诱导抗原特异性T淋巴细胞的长期无反应状态具有重要意义。T淋巴细胞无能是T淋巴细胞产生免疫耐受的主要机制之一[2],无能是指T淋巴细胞的功能性无反应或失活,而不伴有细胞死亡[3]。我们联用抗B721单克隆抗体(抗B721单抗)和抗B722单克隆抗体(抗B722单抗)阻断B7/CD28共刺激途径,在体外诱导T淋巴细胞无能,并分析其体外免疫生物学特性,从细胞水平上探讨无能T淋巴细胞诱导免疫
4、耐受的作用机制,以期建立持续、稳定的移植耐受状态。材料和方法一、材料1.动物:Wistar大鼠及SD大鼠,鼠龄8~10周,雄性,体重150~180g,由中山大学实验动物中心提供。以Wistar大鼠的脾细胞作为刺激细胞,SD大鼠的脾细胞作为反应细胞。2.主要试剂:纯化的功能阻断性小鼠抗大鼠B721(CD80)单克隆抗体、抗B722(CD86)单克隆抗体和小鼠抗大鼠CD3单克隆抗体(抗CD3单抗)均为BD生物科学公司产品;促有丝分裂原刀豆蛋白A(ConA)、丝裂霉素C(MMC)及大鼠重组白细胞介素2(IL22)均为Sigma公司产品;
5、红细胞溶解试剂盒购自R&Dsystems公司;细胞增殖分析试剂盒购自Chemicon国际公司;淋巴细胞分离液(密度1.077g/cm3)由上海恒信化学试剂有限公司生产。二、方法1.大鼠脾细胞悬液的制备:参见文献[4]。收集脾细胞后,用红细胞溶解试剂盒去除红细胞,调整脾细胞浓度为(0.5~1.0)@107/ml。2.Wistar大鼠刺激细胞的制备:参见文献[5]。3.抗B721单抗和抗B722单抗对T淋巴细胞增殖的影响:将刺激细胞和反应细胞(均为4@105个/孔)加入96孔板混合,200Ll/孔,按所加抗体的不同分为4组:(1)抗B
6、721单抗组,各孔分别加入不等量的抗B721单抗,使其终浓度分别为0.001、0.01、0.1、1、10Lg/ml;(2)抗B722单抗组,各孔加入不等量的抗B722单抗,其终浓度同抗B721单抗组;(3)抗B721单抗与抗B722单抗联用组,各孔按上述终浓度加入两种单抗;(4)不加单抗组,为对照组。以上每种条件设3个复孔,均在37e、含体积分数为5%CO2的培养箱中孵育3d后,用细胞增殖分析试剂盒分析反应细胞的增殖情况(以其在480nm波长下的吸光度A值表示,下同)。4.无能T淋巴细胞的制备:将刺激细胞与反应细胞(均为4@106
7、个/孔)加入12孔板中混合,用完全RPMI1640液重悬成3ml/孔,再加入抗B721单抗和抗B722单抗各30Lg(终浓度均为10Lg/ml),在37e、含体积分数为5%CO2的条件下培养5d后,收集细胞,再用完全RPMI1640液培养2d,以淋巴细胞分离液收集淋巴细胞,用RPMI1640液洗2次,每次1500r/min离心10min,弃上清液,所得细胞即为无能T淋巴细胞。5.检测无能T淋巴细胞的增殖能力以鉴定其无能性:将刺激细胞和无能T淋巴细胞(均为4@105个/孔)加入96孔板混合,设3个复孔,在37e、含体积分数为5%CO
8、2的条件下培养7d,每天分析无能T淋巴细胞的增殖情况。以新分离的SD大鼠脾细胞作为对照细胞。6.无能T淋巴细胞对同种异体(SD大鼠)淋巴细胞增殖反应的影响:将刺激细胞(2@105个/孔)与SD大鼠脾细胞(1@105个/孔)加于96孔板混合,100L
