中国生物工程杂志 china biotechnology vol25 no9 2005

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1、中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2005,25(9):84~88长白山药用真菌树舌凝集素的纯化及生化特性*张春玉黄国辉林景卫孙非许守民刘立侠**（东北师范大学生命科学学院长春130024）摘要用硫酸铵分级沉淀、离子交换和HPLC层析等方法，从长白山药用真菌树舌的菌丝体中分离纯化了一种凝集素（Ganodermaapplanatumlectin，简称GAL），SDSPAGE检测其为单一蛋白条带。经过SDS-PAGE测得其亚基分子量为15kDa左右，HPLC分析分子量为58kDa左右，表明GA

2、L由4个亚基组成。氨基酸组成分析表明，GAL中甘氨酸含量较高，不含蛋氨酸和色氨酸，中性糖含量约11.2%。圆二色CD谱显示其含有3.6%的α螺旋、46.8%的β转角和49.6%无规则卷曲，不含有β折叠。GAL可以凝集供试的2种动物血和3种血型人血的血红细胞，但对不同来源的血红细胞凝集滴度不同。糖抑制实验表明，只有棉籽糖和D-松三糖部分抑制GAL的凝血活性。GAL具有较好的热稳定性且其凝血活性不受Ca2+、Mg2+和Zn2+等二价阳离子的影响。关键词树舌凝集素生化特性血凝集活性收稿日期：20050627修回日

3、期：20050805*国家留学青年资助基金(2003),吉林省科技厅重大招标资助项目(200404013)**通讯作者，电子信箱：liulx062@nenu.edu.cn凝集素（Lectin）是一类广泛存在于动植物和微生物中非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，它能与糖专一性地结合，具有凝集血细胞的作用［1］。目前全世界大约有50多种药用真菌凝集素被纯化，其分子量为12~190kDa，含糖量为0%~18％［2］，这些凝集素能够参与和介导细胞中各种生命现象的调节，尤其是其显著的抗肿瘤作用引起了人们的广泛关注。研究表明

4、从灵芝（GanodermaCapense）、金针菇（Flammulinavelutipes）、杨树菇（Agrocybeaegerita）和口蘑（Tricholomamongolicum）等真菌中分离的凝集素都具有很强的抗肿瘤活性［3~6］。由此可见，凝集素是药用真菌的一种主要药理成分。长白山区具有丰富的食用和药用真菌资源，其特产的树舌是具有较高药用价值的大型真菌。本文报道了从长白山来源的树舌菌丝体中分离出天然的凝集素成分，分析了其理化性质、血凝集活性和特点，为药用真菌树舌中生物活性物质的研究和利用提供依据。1材

5、料与方法1.1材料树舌菌种购自吉林农业大学菌物所；小白鼠和家兔购自吉林省生物制品所实验动物中心；正常人血由吉林大学再生医学研究所提供，收集的血配成2%的红细胞悬液。DEAESephadexA25为Pharmacia产品；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris和十二烷基磺酸钠（SDS）等化学试剂购于上海生工生物技术有限公司；低分子量标准蛋白为宝泰克产品；糖抑制实验中所用的糖均为Sigma产品；实验中所用其它试剂皆为国产分析纯。1.2方法1.2.1凝集素的分离纯化称取液体培养的树舌菌丝体60g（鲜重），加入10mmol

6、/LTrisHCl(pH8.0)置冰箱浸泡24h，经高速捣碎机匀浆后，四层纱布过滤，滤液在3500r/min条件下离心20min，收集上清液，向其中加入固体硫酸铵达40％饱和度，低温搅拌20min置4℃冰箱过夜。4000r/min条件下离心30min后弃沉淀，继续向上清液中加入固体硫酸铵达90％饱和度，搅拌、放置、离心同前，最后获取的沉淀透析脱盐后得树舌凝集素（GAL）粗品。取DEAESephadexA25经处理后装柱（2.6cm×40cm）用NaCl液平衡，取上述GAL粗提液（浓度为3mg/ml）上柱，流

7、速30ml/h，5ml/tube，0.1~1.6mol/LNaCl洗脱液4℃层析柜进行线性离子梯度洗脱，收集洗脱峰透析冻干后备用，并进行凝血活性检测。1.2.2凝集素在HPLC上的纯化和检测将冻干后样品用10mmol/LTris-HCl(pH8.0)溶解，经HPLC纯化，条件为：仪器：JapanSHIMADZULC-10AVP系统，检测器：SHIMADZUSPD－10AVP，工作站：CLASS-Vp，色谱柱：TSK-GEL，G3000PWXL，SIL-10ADVP自动进样器进样，流动相0.9%NaCl（pH8.

8、0），流速0.5ml/min，柱温为4℃，压力为1.6mpa,取供试样品（浓度为2mg/ml）1ml，045μm柱头过滤器滤过，设定20μl进样量,记录色谱图。将收集的蛋白峰和记录峰对照进行凝血活性检测，严格收集第1活性峰，透析除盐，冷冻干燥后得GAL纯品。2005,25(9)张春玉等：长白山药用真菌树舌凝集素的纯化及生化特性中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.