大学生实验创新计划项目报告书

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1、大学生实验创新计划项目结题报告书项目名称：七彩山鸡源大肠杆菌产ESBLs的检测及药敏分析主持人：施冲旭所在学院：牧医工程学院专业年级：08级动物医学指导教师:潘玉善职称讲师起止年月：2009年10月至2010年3月填写日期：2010年4月14日七彩山鸡源大肠杆菌产ESBLs的检测及药敏分析 施冲旭、杜艳丽、冯芬芬、黄旭东、翟明胜指导老师：潘玉善摘要：采用全自动微生物鉴定系统（Vitek-32）鉴定了8株七彩山鸡源大肠杆菌，并对分离菌进行超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的检测，及对14种抗菌药和2种复方药物进行敏感性测定。结果显示，分离

2、的8株菌大肠杆菌均不产ESBLs，对药敏试验结果表明该珍禽养殖场分离的大肠杆菌对兽医临床中常用的3大类抗菌药（氟喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类）9种药物均产生高度耐药，显示出严重的多重耐药性。关键词：七彩山鸡；大肠杆菌；超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）；药敏分析七彩山鸡是珍禽品种中养殖比较简单、抗病力强、市场销路大，已在我国南北各地得到普及发展的优良珍禽品种。但近年来，随着养殖规模和养殖区域的扩大，一些常见条件性致病菌如大肠杆菌，也像肉鸡场、蛋鸡场那样常发，给养殖户带来很大的损失。目前，鸡大肠杆菌病的治疗主要依靠抗菌药，但随着抗菌药的广

3、泛、大量甚至不规范使用，细菌耐药性的产生越来越严重，给临床预防和控制该病造成很大困难。2009年7月，荥阳某珍禽有限公司饲养的七彩山鸡于20日龄时开始发病，经药物治疗无效后，送我室求诊，根据其发病情况、临床症状、剖检变化及Vitek-32全自动微生物鉴定仪鉴定，确诊为大肠杆菌感染。为探明该鸡场药物防治失败的原因，本试验对临床分离的8株鸡大肠杆菌进行了ESBLs检测，并用标准K-B纸片法测定了8株菌对14种抗菌药物及2种复方药物的敏感性，以便为掌握鸡大肠杆菌产ESBLs情况以及临床合理选择抗菌药提供科学理论依据。1材料和方法1.1材料1

4、.1.1菌株来源8株试验菌源于2009年7月自荥阳某珍禽有限公司送检患病死亡的七彩山鸡肝脏和心脏分离，并经Vitek-32全自动细菌鉴定仪鉴定的大肠杆菌。质控菌株：大肠埃希氏菌ATCC25922（由中国普通微生物菌种保存中心提供），肺炎克雷伯菌ATCC700603（由北京大学医学部提供）。1.1.2药敏纸片药敏纸片：头孢他啶CAZ、头孢噻肟CTX、氨曲南AZT均为30μg/片，头孢他啶/棒酸CAZ/CA、头孢噻肟/棒酸CTX/CA均为30/10μg/片；阿米卡星（AN）、氨苄西林(AM)、环丙沙星(CIP)、庆大霉素(GM)、链霉素(

5、S)、妥布霉素(TM)、新霉素(N)、米诺环素(MNO)、多西环素(DO)、氨苄西林/舒巴坦(AM/SU)、左氧氟沙星(LVF)、诺氟沙星(NOR)、磷霉素(FOS)、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶(SXT)，以上药物均为北京天坛药物生物技术开发公司生产。1.1.3培养基麦康凯琼脂、MH琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤均购自广东环凯微生物科技公司，SS琼脂购自杭州天和微生物试剂有限公司。1.1.4仪器VITEK-32全自动微生物鉴定系统和GNI革兰氏阴性菌鉴定卡：法国生物梅里埃公司产品；超净工作台（苏净集团安泰公司制造），隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医

6、疗器械厂）等。1.2方法1.2.1细菌的分离、鉴定无菌从病死鸡中挑取少许心、肝组织接种于TSB增菌液中增菌培养18h，再次划线接种于麦康凯琼脂平板上和SS琼脂平板上，37℃恒温培养18h后挑取在麦康凯琼脂平板和SS琼脂平板上单个典型菌落进行纯培养。经涂片、染色、镜检，证实为纯培养物，将其作为试验受试菌株。然后经Vitek-32全自动微生物鉴定系统进行鉴定。1.2.2ESBLs的检测按美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的表型确证试验法进行：将浓度为0.5个麦氏单位的受试菌液用无菌棉签涂布于MH平板，分别两两对应贴上头孢他啶（CAZ

7、，30　μg/片），头孢他啶/棒酸（CAZ/CA，30　μg/10　μg/片），头孢噻肟（CTX，30μg/片），头孢噻肟/棒酸（CTX/CA，30　μg/10　μg/片）纸片，37℃培养16h，测量抑菌圈大小。当两组药物中有任意一组中有加CA的抑菌圈直径比不加CA的抑菌圈直径相差≥5mm，即确定为产ESBLs菌株。1.2.3药物敏感性试验采用标准K-B纸片法，测定药物对细菌的抑菌圈大小（mm），试验结果按照CLSI[7]标准判读敏感、中介和耐药。2结果与分析2.1细菌分离鉴定结果临床分离的8株细菌在麦康凯琼脂平板和SS琼脂平板上均形

8、成粉红色菌落；分离株经纯化培养后，经Vitek全自动细菌鉴定仪和GNI+革兰氏阴性菌鉴定卡鉴定，结果为大肠杆菌。2.2ESBLs检测结果8株山鸡大肠杆菌产ESBLs的表型确认试验结果见表1，从表1可以看出：在确证试验中8