一例规模猪场正常分娩产死胎增加的病原诊断报告

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1、一例规模猪场母猪正常分娩而死胎增加的病原诊断报告夏伟1，张宇辉1，马迪杨1，危艳武2，刘长明2（1.哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江哈尔滨150069；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001）吉林省某规模猪场母猪存栏500多头，2012年8月份向笔者反映猪场最近3个月以来经常出现正常分娩的母猪产仔死胎比例增加的现象，母猪未见任何异常症状，而且死亡的胎儿新鲜，体重较大，未见木乃伊化以及畸形；剖检时发现死亡胎儿肺脏充血、出血、水肿、间质增宽；肾脏肿大,充血，脐带出血等病理变化。为

2、了确诊该猪场母猪产仔死胎增加的病因，我们应用PCR,RT-PCR方法对常见的能够引起母猪繁殖障碍的猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、细小病毒(PPV)、日本乙型脑炎病毒（JEV)进行了检测，结果确诊猪繁殖与呼吸综合征变异毒株(HPPRRSV)，俗称高致病蓝耳病病毒是引起本场母猪产死胎增加的主要原因，关于高致病蓝耳病病毒(HP-PRRSV)引起猪群母猪流产风暴和高热性疾病的报道很多，但正常分娩而死胎增加为特征的病例报道较少，临床上发病率较高而没有引起普遍重视。因此本

3、报告对高致病蓝耳病病毒引起猪场群发性、持续性产死胎的临床诊断具有重要的借鉴意义，我们将有关诊断报告如下。1材料与方法1.1病料来源采自吉林长春市某猪场死胎病料3头（肺、腹淋、脾），剖杀断奶消瘦仔猪2头（脾、淋巴结）。编号后冷冻运送，-20℃保存备用。1.2酶和其他试剂PCR和RT-PCR扩增试剂盒、饱和酚、TaqDNA聚合酶、dNTPs、EB、DEPC水、TRIZOL(总RNA抽提试剂主要成分苯酚等）、DL2000Marker、TaKaRaRNAPCRKit（AMV）Ver.3.0均购自宝生物工程（大连）有限公司

4、。1.3引物设计与合成根据GenBank发表的PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株）、CSFV（猪瘟病毒）、PCV2（圆环病毒2型）、PRV(伪狂犬病毒)、PPV（猪细小病毒）、JEV（猪乙型脑炎病毒）.用Oligo6.0软件设计引物，扩增PRRSV的上游引物：5′-ACCATGGAGGAGGATCTGCTAAAAC-3′；下游引物：5′-CTGGTAAGCAGACGTGTTGCG-3′，扩增缺失株（高致病性PRRSV毒株）目的片段长度为843bp；扩增PCV2的上游引物：5′-CAGCAAGAAGAATG

5、GAAGAAGCGGA-3′，下游引物：5′-CCAGGACTACAATATCCGTGTAACT-3′，扩增目的片段长度为1057bp；扩增CSFV的上游引物：CSFV-F：5′-CCTGACGCCACGATT-3′，下游引物CSFV-R：5′-GGGGACTCC（G）TTGCATATTTTT（T）-3′，扩增目的片段长度为603bp；扩增PRV的上游引物：gEl：5'-CCGCGGGCCGTGTTCTTTGT-3’和下游引物：gE2：5'-CGTGGCCGTTGTGGGTCAT-3'，扩增目的片段长度493bp

6、[1]；扩增PPV的上游引物P1：5'-CGACGAAGCCTACGACAAATAC-3'和下游引物P2：5'-TGCTGGTAGTGTTCCTGGGTG-3'扩增vp2基因的目的片段长1255bp[2]。扩增JEV的上游引物：5′-AACAGCATGCAAATCGAAGAC--3′，下游引物５′-CCAGAAACATCACCAGAAGG--3′，引物扩增NS1基因的目的片段500bp[3]；以上引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成。1.4病料处理及核酸提取将临床病例的组织样品利用研磨器充分研磨，利用MEM营养

7、液进行10倍稀释，然后利用DNA和RNA提取试剂盒进行核酸抽提。1.5病毒核酸检测1.5.1猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒的扩增分别用BIOZOL总RNA提取试剂盒（博日公司）从病毒培养液提取总RNA为模板，采用TaKaRaOneStepRNAPCRKit（AMV）试剂盒进行RT-PCR扩增，反应条件RT:50℃30min，94℃2min；PCR：（94℃30s，58℃30s，72℃1min）×35个循环，72℃延伸7min，PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.5.2猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、细小病毒

8、的扩增[1][2]分别用天根生物科技有限公司DNA提取试剂盒，从病毒培养液提取DNA为模板，采用TaKaRaOneStepDNAPCRKit试剂盒进行PCR扩增，反应条件94℃2min；（94℃30s，55℃30s，72℃1min）×35个循环，72℃延伸10min，PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.5.3猪乙型脑炎病毒的扩增[3]用Ｔｒｉｚｏｌ提取病料总ＲＮＡ