诺如病毒rt-pcr方法的建立及其江苏部分地区的流行病学研究

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1、、＇．六资確寒零＾．４為知Ｓ鸿；？挥｜＃３兴怒Ｗ黎在參？：满伊难满硕去学住备文．气心：（学术型）＾：＾更＜云安－＞＾參－户－＇一參语如病毒ＲＴ．ＰＣＲ方法的建立及其江苏部分地区？／＊的流行病学研究、每若少％＾，心急－孝以、巧序、？一？＇＃＇於《＾给’指导教师姓名焦新安教授，扬州大学，江苏扬州，２２５００９＾／－ｆｅ＾；ｒ：ｓｓＯ黄金林教授＊，扬州大学，江苏扬州，２２５００９申请学位级别：硕去学科专业名称：预巧兽医学一＼＾？＇？２０１５？．０４．，论文提交日期：论文答辩日期；２０１５．０６．０３

2、？决＿＿＿、＇、、、学位授予单位；扬州大学学位授予日期．０６．３０；２０１５：．、答辩委员会主脱下’—．£．．：！．，，為罪＇彎編脚＇＊＇＾又记茶＇瓦＞．＾遙会以鹿方策１Ｔ－ＰＣＲ方钱明明：诺如巧巧Ｒ法的建立及其江苏部分地区的流行病学研究诺如病毒ＲＴ－ＰＣＲ方法的建立及其江苏部分地区的流行病学研究研究生：钱明明导师；焦新安教授黄金林教授中文摘要一诺如病毒（Ｎｏｒｏｖｉｍｓ，ＮＶ）是引起非细菌性急性胃肠炎的主要病原体之，近年來由诺如病毒引起的疫情暴发与流行逐渐增多，日益成为重要的公共卫生问题。由于诺如病毒尚不能体

3、外培养，且极易发生变异，传统的血清学及免疫学检测方法存在很大局限性，目前ＷＰＣＲ为核也的分子生物学检测方法成为检测诺如病毒的主要研究方向。本研究通过民Ｔ－－ＰＣＲ与英光定量ＲＴＰＣＲ检测方法，建立常规，对水体样品的前处理进行研究并运用一建立的方法对采集于江苏部分地区的临床，为、牡嘛和水体样品进行检测与评价进步完善诺如病毒的检测提供依据。同时了解江苏部分地区诺如病毒的污染状况，分析其分子流行病学特征，为诺如病毒的风险评估及分子流行病学调查提供基础数据。—－－、诺如病毒常规民ＴＰＣ民与巧光定量民ＴＰＣＲ检测方法的建立及比较０民Ｆ－针对诺如病毒衣売蛋白保守区

4、及１ＯＲＦ２连接处的基因序列设计引物、探针，优ＲＴ－ＰＣＲ和巧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测方法化反应体系，建立常规。运用建立的方法对其他肠道病毒进行检测，均无交叉反应，表明该两种方法具有良好的特异性拷贝数的诺如；不同３ＲＴ－ＰＣ艮检－病毒检测结果显示常规测限为１０ｃｏｐｉｅｓ／ｎＬ，英光定量ＲＴＰＣＲ检测限为＾ｌＯｃｏｐｉｅｓ仙。对不同稀释梯度含有ＧＩ型、ＧＩＩ型诺如病毒目的基因的标准重组质粒进行２８ＲＴ－ＰＣ民￣〇，结果Ｇ１ｅｓ巧光定量反应Ｉ型标准质粒在１００）ｐｉ／阵范围内有良好的线性关系，Ｘ２Ｙ＝５８５－３ｘ４０．３Ｈ民７Ｅ８８９％标准曲线为．（ｌ，相关系数

5、达到０．９９，扩増效率ｆ为１００．创Ｉｇ；ｉ８￣型标准质粒在１０ｃｏｉｅｓ／ｉＬ范围内有良好的线性关系，标准曲线为ｌ〇ｐ｜Ｘ２。Ｙ＝４０６６－２９ｘ￣，民达到０６，Ｅ５７，．６３．２ｌ．９９ｆ为１０４．０巧／〇批内变异系数在０．１８％０．％之间ｇ；￣－〇．７１％２．６２％之间，表明巧光定量ＲＴＰＣＲ具有良好的重复性批间变异系数在。运用建立的常规ＲＴ－ＰＣ民和巧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法对２２份临床样品进行同步检测，并－与南通市疾病预防控制中也的检测结果相比对，常规ＲＴＰＣＲ敏感度、特异度分别为７１４１－，９０１ＰＣ民检．３％、００％符合率这到．９％ＲＴ；巧

6、光定量测结果与南通市疾病预防控制一一８０－中必完全致。运用建立的两种方法进步对１份临床样品进行检测，其中常规ＲＴＰＣＲ５－，符合率达９７ＴＰＣＲ，阳性率为．％％．２２％；巧光定量Ｒ阳性率为８．如％符合率达１００％；统计分析两种方法的检测率有显著性差异（Ｐ＜〇．〇５），并对阳性样品测序，结果证实均为诺扬州人学硕十学位论文Ｉ如病毒。二、水中诺如病毒富集方法的建立及优化采用国内常见的混合纤维素酷滤膜，对人为污染诺如病毒的水样进行病毒富集，优化滤膜的吸附与洗脱过程，建立水体病毒富集方法。在吸附过程中对水样ｐＨ值、多价阳离子及离子浓度进行优化，，随后在

7、洗脱过程中优化洗脱液及其ｐＨ值和浓度。研究结果思示在吸附水体病毒过程中，当水样ｐＨ值为３．５时，病毒平均吸附率为２８．９６％，吸附效果优于其＋２＋３＋它阳值；向水样加入Ｎａ、Ｍｇ、Ａ１，Ｈ种离子的平均吸附率分别４８．４２％、２８．９６％、１８．２８％，＋＋＋＋２３Ｎａ吸附效果优于Ｍｇ和Ａ１Ｎａ．２ｍｏＬ时，；当水样中浓度为０ｌ／，滤膜吸附效果较好平均＋７２－－－吸附率高达．１５％，优于Ｎａ其它浓度。在洗脱滤膜过程中，ｌ％ＮａＰＰＰＢ甘氨酸０．５％吐