池蝶蚌亲环蛋白的分子特征和功能研究

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1、分类号：密级：UDC：学号：405604412014南昌大学硕士研究生学位论文池蝶蚌亲环蛋白的分子特征和功能研究Studyonmolecularcharacteristicsandfunctionofcyclophilinsinfreshwaterpearlmussel,Hyriopsisschlegelii罗春培养单位（院、系）：生命科学学院指导教师姓名、职称：洪一江教授专业学位种类：理学专业领域名称：动物学论文答辩日期：2015年5月31日答辩委员会主席：评阅人：2015年5月31日一、学位论文独创性

2、声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名（手写）：签字R期：？年6月’円二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，

3、允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库〉〉中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按“章程”规定享受相关权益。学位论文作者签名（手写）:导师签名（手写）：闩签字闩期：年6月/闩论文题目姓名II学号论文级别博士□硕士0院/系/所专业联系电话E_m

4、ail通{g地址(邮编)：备注：□公开□保密（向校学位办申请获批准为“保密’年月后公开）摘要摘要池蝶蚌（Hyriopsisschlegelii）产于日本滋贺县的琵琶湖，比其它淡水珍珠蚌具有更好的抗病能力。本研究以淡水贝池蝶蚌为实验对象采用RACEPCR方法获得了其亲环素蛋白家族（Cyps）中CyPD、CyPC和CyPH的cDNA基因全长：池蝶蚌CyPD基因cDNA（GenBank注册号：KJ747387。）全长为2671bp，5’-非翻译区（UntranslatedRegion,UTR)80bp，其中3’

5、-UTR1487bp包括一个多聚腺苷信号AAATAA和Poly(A)尾巴，1104bp的开放性阅读框（Openreadingframe，ORF）编码367个氨基酸，分子量约为41.09kDa，理论等电点pI=5.43；池蝶蚌CyPC基因cDNA全长为2050bp，5’-UTR89bp，其中3’-UTR500bp包括一个多聚腺苷信号AAAATAA和Poly(A)尾巴，1461bp的ORF编码486个氨基酸，分子量约为55.93kDa，理论等电点pI=6.07；池蝶蚌CyPH基因cDNA（GenBank注册号

6、为KJ747386。）全长为761bp，5’-UTR70bp，其中3’-UTR151bp包括一个多聚腺苷信号AAAATAA和Poly(A)尾巴，ORF540bp编码179个氨基酸，分子量约为19.66kDa，理论等电点pI=7.60。生物信息学分析表明，CyPD、CyPC和CyPH具有典型的亲环素肽酰脯氨酸顺反异构酶蛋白功能域，同时构建的系统进化树表明在进化地位上也相当保守。用CyPB基因完整的ORF与pET-32a构建pET-32a-CyPB重组表达载体，将重组质粒导入表达菌BL21（DE3）中进行原核

7、表达，发现IPTG成功诱导了分子量约为40kDa的HsCyPB蛋白；结果还显示蛋白主要存在于上清中，因而利用镍离子亲和层析法纯化上清获得单一的融合蛋白。纯化的HsCyPB作为抗原免疫日本大白兔制备的多克隆抗体，抗体的效价高达1:512000，说明获得效价很高的抗体，而且Westernblot检测结果表明制备的多克隆抗体具有很好的特异性；利用HsCyPB的抗体对池蝶蚌肝脏冰冻切片进行免疫荧光定位，发现HsCyPB蛋白在细胞质和细胞膜上都有表达。荧光定量PCR结果发现CyPA、CyPB在池蝶蚌的八个组织中均有

8、表达，并且在肝脏中表达量最高，其次是在肠和性腺，血中的表达量最低；根据池蝶蚌CyPA、CyPB基因的cDNA全长序列，构建含有完整开放阅读框(ORF)的pEGFP-C1-CyPA、pEGFP-C1-CyPB表达载体；在转染实验过程中，人肝癌细胞（HePG2）作为实验细胞，pEGFP-C1质粒作为对照组A，pEGFP-C1-CyPA作为I摘要实验组B，pEGFP-C1-CyPB作为实验组C，pEGFP-C1-CyPA＋pEGFP