杉木microrna399a的功能研究

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1、单位代码10476学号1204180354分类号Q58H^kf硕士学位论文杉木火z的功能研究学科、专业：生物化学与分子生物学研究方向：酶的功能与应用申请学位类别：理学硕士申请人：祝艾静指导教师：王林嵩教授二〇一五年五月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研宄成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。作者签名:曰期：关于论文

2、使用授权的说明本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，8卩：有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）作者签名:导师签名:日期：FUNCTIONALANALYSISOFmicroRNA399aINCHINESEFIRADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinParti

3、alFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByZhuAijingSupervisor:Prof.WangLinsongProf.QiuZongboMay2015摘要microRNAs(简称miRNA)是一类长约20～24个碱基的内源性单链RNA，它广泛的存在于原核、病毒和真核生物中。miRNA通过对靶基因mRNA的互补配对介导靶mRNA的降解或抑制蛋白水平的翻译，从而对靶基因的表达进行转录后的负调控。近些年的研究表明，miRNA对植物的生长发育和某些器官形成的各个阶段都具有重要调控作用。目前

4、研究发现miR399存在于拟南芥、水稻和小麦等多种植物中，是植物中一类保守的miRNA。但是，目前对Cln-miR399a的生物学功能以及其自身的转录调控仍知之甚少。本论文运用了生物信息学、分子细胞学、高通量测序和遗传学等方法，以模式植物拟南芥为研究材料，构建35S：Cln-miR399a前体的表达载体，获得了Cln-miR399a过表达的拟南芥转基因纯合株系，展开了Cln-miR399a在拟南芥的表达模式和调控机制的研究。通过分子细胞生物学和转基因株系表型的观察得到以下结果：（1）通过高通量测序和生物信息学的方法，从杉木基因组DNA中鉴定并克隆了杉木Cln-miR

5、399a的前体序列；根据Cln-miR399a高度保守的结合位点特征，在杉木基因组数据库中预测和分析其潜在的靶基因，初步确定靶基因为Unigene56556，并且其成熟序列和拟南芥miR399c的成熟序列完全相同；（2）构建过表达35S：Cln-miR399a载体，采用实时荧光定量PCR技术检测，发现杉木miR399a能够在拟南芥中异源表达；并且在开花期和果荚期，Cln-miR399a在叶片的表达水平高于根部，而在根和叶中，果颊期Cln-miR399a的表达量较高，初步明确Cln-miR399a在拟南芥中存在时空表达特异性；（3）实时荧光定量PCR（Real-tim

6、ePCR）进一步分析显示，Cln-miR399a能够使靶基因PHO2的表达量显著下调；通过5’RACE实验，明确的验证出了Cln-miR399a对同源靶基因Unigene56556的切割位点在第21和22位之间。烟草瞬时转化实验结果进一步显示，杉木miR399a能够对其同源靶基因Unigene56556和异源靶基因PHO2都有一定的切割作用；（4）对过表达Cln-miR399a转基因植株研究结果显示，与野生型相比，转基因植株Cln-miR399a呈现出主根变长、幼叶结构改变、株高增加、叶片总数减少、开花提前以及角果个数增加等表型性状，初步确定过表达对植物生长发育具有

7、一定的调控作I用。关键词：杉木，MicroRNA，拟南芥，靶基因IIABSTRACTMicroRNAs(miRNAs)are20-24ntendogenoussmallnon-codingRNAwhichwidelyexistinviruses,prokaryotesandeukaryotes.TheydegradatestargetmRNAsorinhibitstheirtranslationbydirectlybindingtothecomplementarysequencesoftargetmRNAssoastonegativelyregulategene