低氧损伤下pc12细胞自噬与凋亡的关系研究

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1、上海交通大学硕士学位论文低氧损伤下PC12细胞自噬与凋亡的关系研究硕士研究生：汪文英学号：1127259575导师：江伟申请学位：硕士专业：麻醉学研究方向：低氧损伤资助基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20120073110087）培养单位：上海交通大学附属第六人民医院答辩日期：2015年5月DissertationSubmittedtoShanghaiJiaoTongUniversityfortheDegreeofMasterRelationshipbetweenautophagyandapoptosisinPC12c

2、ellsunderhypoxiainjuryCandidate：WenyingWangStudentID:1127259575Supervisor：WeiJiangAcademicDegreeAppliedfor：MasterSpeciality：AnesthesiologyDirection:HypoxiainjuryAssistanceFundProject：RFDP(20120073110087)Institution:SixthPeople’sHospitalDateofDefence：May,20151上海交通大学硕士

3、学位论文2上海交通大学硕士学位论文3上海交通大学硕士学位论文低氧损伤下PC12细胞自噬与凋亡的关系研究中文摘要第一部分低氧损伤诱导PC12细胞自噬激活目的初步探讨在低氧损伤下神经元样肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）自噬的发生情况。方法通过低氧培养箱建立细胞低氧损伤模型；构建GFP-LC3质粒；分别在给予或者不给予溶酶体质子泵抑制剂BafA1的情况下，通过westernblot法检测自噬相关蛋白的表达；RT-PCR法检测自噬小体表面微管相关蛋白1轻链3（LC3）mRNA水平的表达；激光共聚焦显微镜检测LC3的表达及分布变化。统

4、计学分析低氧损伤与细胞自噬之间的关系。结果westernblot结果显示，低氧损伤下，PC12细胞自噬相关蛋白的表达明显随着低氧时间的延长而增加，24小时后出现下降；RT-PCR结果显示，低氧损伤下，LC3的mRNA水平明显上调；激光共聚焦显微镜检查结果显示，低氧损伤下，细胞内含有GFP-LC3颗粒的自噬小体明显增多。自噬的发生与低氧损伤之间存在相关性。结论低氧损伤能诱导PC12细胞发生自噬，两者之间存在相关性。关键词：PC12细胞；低氧；自噬4上海交通大学硕士学位论文第二部分自噬激活在低氧损伤中的作用及其机制目的以对低氧敏感的

5、神经元样PC12细胞为低氧损伤模型，探讨低氧诱导的自噬激活在低氧损伤中发挥的作用及其机制。方法通过低氧培养箱建立细胞低氧损伤模型；体外给予细胞自噬抑制剂3-MA，通过MTT方法检测细胞活力；LDH法检测细胞毒性；PI染色检测细胞死亡情况；caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3的活性；westernblot方法检测caspase-3的活性形式cleavedcaspase-3的表达变化。统计学分析低氧损伤下抑制细胞自噬后细胞活力及凋亡变化及其相关性。结果MTT结果显示给予自噬抑制剂3-MA后，低氧损伤的细胞活力进一步

6、降低；LDH结果显示给予自噬抑制剂3-MA后，低氧损伤的细胞细胞毒性进一步增强；PI染色结果显示给予自噬抑制剂3-MA后，低氧损伤的细胞死亡进一步增多；并且caspase-3的活性及活性形式表达检测结果显示，给予自噬抑制剂3-MA后，caspase-3的活性增强，其活性表达形式cleavedcaspase-3的表达增多。结论低氧损伤下，自噬发挥细胞保护作用，这种保护作用可能与抑制凋亡有关。关键词：自噬；保护；凋亡5上海交通大学硕士学位论文第三部分凋亡抑制自噬活动目的低氧损伤24小时后自噬活动逐渐减弱，而凋亡活动逐渐增强。凋亡对自

7、噬是否影响及其可能的机制尚不完全明了。本研究目的是初步探讨低氧损伤的后期凋亡的增强是否导致自噬的减弱，两者之间是否存在相关性。方法通过低氧培养箱建立细胞低氧损伤模型；构建Flag-BaxWT，Flag-BaxS184V和Flag-BaxΔC过表达质粒；将EGFP-LC3分别与Flag-BaxWT（或Flag-BaxS184V，Flag-BaxΔC）共转染细胞，westernblot检测自噬相关蛋白的变化；给予细胞凋亡抑制剂z-VAD-FMK，蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂氯喹，westernblot检测共转细胞内LC3表

8、达的变化；细胞低氧时给予细胞凋亡抑制剂z-VAD-FMK，westernblot检测LC3表达的变化。结果westernblot结果显示，当EGFP-LC3与野生型Flag-BaxWT或激活性Flag-BaxS184V质粒共转时其表达明显减少，而与突变型Flag