伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫免疫逃逸中的功能分析

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1、伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫免疫逃逸中的功能分析ThefunctionofTrichinellapseudospiralisserpininparasitesimmuneevasion作者姓名：王艳凤专业名称：预防兽医学指导教师：刘明远教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月2日中文摘要伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫免疫逃逸中的功能分析旋毛虫病是由旋毛虫属（Trichinellaspp.）线虫引起对人类健康构成巨大威胁的食源性人兽共患寄生虫病。据目前统计，在世界范围内约有1000多万人被感染，

2、在我国该病仍有发生。在旋毛虫中已报道十二个种中，伪旋毛虫是唯一一种既可以感染哺乳动物也可以感染鸟类的虫种，感染宿主范围广，具有异于其它种的特殊感染特点。丝氨酸蛋白酶抑制剂是能够抑制丝氨酸蛋白酶及半胱氨酸蛋白酶的蛋白酶抑制剂超家族，参与调控凝集、炎症和凋亡等生理过程，广泛存在于哺乳动物、植物、蠕虫、昆虫、微生物乃至某些病毒之中。伪旋毛虫的肌幼虫由于无包囊保护，更容易受到宿主免疫攻击，但是伪旋毛虫却能成功寄生于宿主肌细胞内，造成整个肌细胞感染引发强烈炎症。因此，伪旋毛虫必然产生更强的免疫抑制来逃避宿主的攻击。迄今

3、为止伪旋毛虫免疫逃逸相关分子的调控机制仍然未知，研究伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在免疫调节过程中的作用具有极其重要的意义。首先，本研究根据GenBank中伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂（Trichinellapseadospiralisserineproteinaseinhibitor,Tp-Serpin）基因序列设计特异性引物，RT-PCR克隆得到Tp-Serpin基因，构建重组表达质粒pET-28a-Tp-Serpin。转化大肠埃希菌中，通过优化表达纯化条件获得高纯度的可溶性重组蛋白，利用生物化学方法即底物特异

4、性反应对其抑制宿主的丝氨酸蛋白酶活性进行分析。研究发现rTp-Serpin对小鼠肥大细胞糜蛋白酶，人中性粒细胞弹性蛋白酶以及猪胰脏弹性蛋白酶均有明显的抑制作用。我们推测伪旋毛虫通过分泌Serpin来抵抗源自宿主肠道消化酶对其损伤，发挥抗炎作用，逃避宿主免疫攻击而达到长期寄生。其次，通过rTp-Serpin重组蛋白与J774A.1小鼠巨噬细胞的共培养并经脂多糖（LPS）刺激，通过采用CCK-8、SYBRGreenI实时荧光定量PCR、ELISA分析rTp-Serpin对Toll样受体介导的对巨噬细胞活性的影响。

5、结果表明，rTp-Serpin降低了LPS刺激的巨噬细胞分泌促炎性细胞因子及效应分子iNOS的I表达，促进抗炎性细胞因子及替代性活化的巨噬细胞（AAM）标记物Arg1分泌表达。另外我们通过Westernblot技术检测rTp-Serpin对JAK2/STAT3信号通路的磷酸化情况，结果表明，JAK2/STAT3信号通路可能介导rTp-Serpin诱导巨噬细胞向AAM型转化，发挥抗炎功效。我们推测伪旋毛虫可以通过丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制炎症反应，诱导巨噬细胞向可替代激活表型转换。最后，利用半定量RT-PCR技术对

6、Tp-Serpin抗原基因在伪旋毛虫不同发育时期中的转录水平进行鉴定。制备不同感染时期的裸虫切片，利用特异性多克隆抗体，采用Westernblot、免疫组织化学技术对Tp-Serpin抗原基因在伪旋毛虫生活史中的表达特性进行鉴定，探讨此抗原基因作为伪旋毛虫诊断抗原的可能性，为深入研究伪旋毛虫宿主入侵、免疫逃避及发育机制奠定了基础。半定量RT-PCR结果显示，Tp-Serpin基因在伪旋毛虫各个时期均有表达。Westernblot分析显示抗rTp-Serpin血清能够识别伪旋毛虫虫体粗抗原而与ES产物反应较弱，

7、此外免疫组化结果表明，Tp-Serpin蛋白主要分布于虫体表皮，由此推测Tp-Serpin蛋白很可能是一种由虫体表皮细胞合成分泌的功能蛋白，发挥细胞外作用，从而能够抵抗宿主肠道环境中消化酶对虫体的损伤，参与抗炎及逃避宿主对虫体的免疫效应，达到在宿主体内的长期寄生。关键词：伪旋毛虫；丝氨酸蛋白酶抑制剂；原核表达；蛋白酶抑制活性；巨噬细胞IIAbstractThefunctionofTrichinellapseudospiralisserpininparasitesimmuneevasionTrichinello

8、sisisawidespreadfoodbornezoonoticdiseasewhichposesagreatthreattohumanhealth,andithasbeenestimatedthatmorethan10millionpeopleareinfectedwithTrichinella.ThereisstillahighprevalenceinChina.Inthereported12