试析新型毛细管电泳光学检测器的研制及应用研究

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1、四川大学博士学位论文新型毛细管电泳光学检测器的研制及应用研究姓名：赵书林申请学位级别：博士专业：化学工程指导教师：肖丹20060415摘要新型毛细管电泳光学检测器的研制及应用研究专业：化学工程研究生：赵书林指导教师：肖丹(教授)高效毛细管电泳(CE)是近年来发展最快的分离分析技术之一，由于该技术具有简单、高效、快速、微量、经济、清洁、易于自动化和环境污染少等优点，目前已在生命科学、生物医学和环境检测等领域中得到了广泛应用。由于CE溶质区带的超小体积导致光程太短，需要高灵敏度的检测器与之匹配，因此检测器的研制一直是CE技术发展的关键问题。目前已采用的检测器主要有：紫外可见光吸收、激光诱导荧光、

2、化学发光(CL)、质谱、核磁共振和电化学检测器等，其中激光诱导荧光和cL是最灵敏的两种检测器。但常规的激光诱导荧光检测器，必须采用激光器作为激发光源，例如氩离了激光器和氦一镉激光器，这些激光器不仅可供选择的激发波长有限，而且价格昂贵、体积庞大，使用寿命短，因而大大限制YCE激光诱导荧光检测法的应用。而对于CE．CL检测，尽管已发展了多种类型的检测器，但目前的高灵敏检测主要集中在无机离子的检测方面，而用于检测生物活性分子，其灵敏度一般都不高，在生物样品分析中的应用也较少。因此，研制通用性的高灵敏光学检测器，建立高灵敏CE分离分析方法，并应用于生物样品分析，对于推动生命科学和生物医学研究的发展，

3、具有重要的意义。本研究工作旨在发展一些新的CE光学检测器，建立生物体内一些重要生物新型CE光学榆删器的研制及应用研究活性分子的高灵敏检测方法，并应用于实际样品分析，从而获取～些有重要价值和理论意义的数据和新发现。为此主要开展了以下三个方面的工作。1．设计组装了CE光导纤维发光二极管(LED)诱导荧光检测器，并建立相应的CE分析系统。该系统以非常便宜的LED作为激发光源，用光导纤维将光直接导入毛细管内，在溶液中激发被测物质产生荧光，避免了毛细管壁的散射和反射现象，因而具有较高的灵敏度。以萘二甲醛(NDA)标记的氨基酸和荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的氨基酸混合物为试验化合物，考察了该系统的分

4、离和测试性能。实验结果表明该系统具有良好分离效果，高的灵敏度，检测限在10一～10一t001．L。1之间，各种性能接近CE激光诱导荧光检测系统。另外，由于在紫外和可见光范围内，各个波长段均可得到相应的LED，因而与CE激光诱导荧光检测系统相比，该检测系统具有更加广泛的应用前景。利用该系统，已分别建立了牛物样品中胍基丁胺和D．天冬氨酸，D．谷氨酸的CE分析方法。并对大鼠大脑、大鼠胃及人血清、人尿液中的胍基丁胺的含量进行了测定，首次测得人尿液中含有30～60ng／mL．的胍基丁胺。应用于小鼠大脑中D一天冬氨酸和D一谷氨酸的含量测定时，对其注射神经毒素1．甲基。4一苯基．1．2_3．6．四氢吡啶(

5、MPTP)，使其发生了帕金森疾病症状后的小鼠大脑组织中，对D．Asp和D．Glu含量的变化情况进行了考察。发现随MPTP用药时间的增长，帕金森疾病的症状愈来愈明显，其D．Asp和D．Glu含量亦明显增高，用药5天后含量达最大值。为生物医学研究提供了有重要参考价值和理论意义的数据。2．设计组装了一套新的CE—CL检测系统。该系统采用四通式接口和套管式在线活动检测窗口，光电倍增管紧贴反应毛细管的检测窗，并在检测窗口’F放鹭一面反光镜。因此检测池密闭性能好，收集CL的效率高。与现有大多数CL检测器相比，测定氨基酸时的灵敏度提高了一个数量级。利用该系统，分别建立了生物样品中11-}+酸，氨基酸和对乙

6、酰氨基酚等物质的测定方法，并已分别应用于叶酸片剂、果汁和人尿液中叶酸含量的测定，人血清中】4种氨基酸含量的测定，以及人尿液中对乙酰氨基酚含量的测定，并对对乙酰氨基酚的人体内药代动力学进行了研究。采用CE．CL检测技术测定上述物质，灵敏度高，II摘要选择性好，国内外均未见有同类工作报道。3．组装了一套CE激光诱导荧光检测系统，利用该系统建立了大鼠大脑中D．丝氨酸含量的CE激光诱导荧光检测方法。该方法以4．氟一7一硝基．2，1，3．苯并嗯二唑(NBD．F)为衍生试剂，羟丙基一B．环糊精为手性选择剂，对D／L一丝氨酸对映体的NBD—F衍生物，进行了手性拆分研究，并对大鼠大脑中D一丝氨酸的含量进行了

7、检测。测得大鼠大脑中D．丝氨酸含量在95～140nmol／g之间。另外，利用该系统建立了大鼠大脑中D／L一天冬氨酸含量的测定方法，并测定了在正常和脑缺血情况F，大鼠大脑皮质中D／L一天冬氨酸的含量。结果发现，在正常情况下每克湿的大脑皮质组织中．含14218nmolL．天冬氨酸和49．1nmolD一天冬氨酸，但在脑缺血情况下，L．天冬氨酸的含量快速升高，而D一天冬氨酸的含量反而降低。脑缺血30rain时，L．天