不同倍性及亲子代泥鳅的dna甲基化差异分析

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1、类号密级UDC编号硕士学位论文不同倍性及亲子代泥鳅的DNA甲基化差异分析徐雯（1214030）指导教师姓名李雅娟教授专业名称水产养殖论文答辩日期2015年6月5日学位授予日期2015年月AnalysisthelevelandpatternonGenomicDNAmethylationindifferentploidyandparent-offspringsforloachesByXuWenAMaster'sDegreeofAquacultureSupervisor:ProfessorLiYaJuan本研究由国家自然科学基金（31272650）和大连海洋大学博

2、士启动基金项目（017208）资助摘要摘要为探讨不同倍性及亲子代泥鳅基因组DNA的甲基化水平及模式差异，本研究以自然多倍体（二倍体、三倍体和四倍体）及亲子代（四倍体♀×二倍体♂）泥鳅为研究对象,利用正交实验建立了泥鳅甲基化敏感扩增多态性（Methylationsensitiveamplifiedpolymorphism,MSAP)方法的反应体系。并利用该方法对其基因组DNA甲基化水平与模式进行了MSAP分析。结果表明：（1）泥鳅MSAP技术反应体系的建立及优化本研究优化并建立最佳泥鳅MSAP反应体系，包括800ng的泥鳅基因组DNA，用EcoRI，HpaII

3、和MspI各10U，在37℃8h后即可酶切；最佳的预扩增反应体系是预扩2+增引物0.8μL、dNTPs0.2mmol/L、Mg1.5mmol/L和Taq1U；最佳的选择性扩增反应2+体系是预扩增产物稀释20倍DNA2μL、引物1.5μL、dNTPs0.375mmol/L、Mg1.5mmol/L和Taq1U。该体系稳定、可靠、重复性好，为MSAP技术在泥鳅相关研究中的应用奠定了基础。（2）不同倍性泥鳅基因组DNA甲基化的水平及模式差异分析。本研究选用自然二倍体、自然三倍体和自然四倍体泥鳅为研究对象，在25对选择性扩增引物组合中选出6对引物，共获得1431个位点

4、。对比分析甲基化水平及模式发现，二倍体、三倍体及四倍体总甲基化率分别是39.98%、33.72%和32.36%。分析这些位点的甲基化模式表明：甲基化模式在三个倍性间类型相同占所检测位点的24.1%，仅两种倍性相同的为60.9%，各不相同的为15.1%。比较泥鳅多倍体间相同的甲基化带型模式，二倍体与三倍体相同的甲基化模式率为38.6%，二倍体与四倍体相同的甲基化模式率为41.8%。表明在染色体加倍的过程中，总甲基化率随着染色体的加倍而降低，三者之间甲基化模式的差异表达并未发生很大变化，但两两之间却存在较大差异，与三倍体相比，四倍体的甲基化模式与二倍体更加接近。

5、（3）亲子代泥鳅基因组DNA甲基化的水平与模式分析以自然四倍体泥鳅为母本、自然二倍体泥鳅为父本及其后代杂交三倍体（1龄）泥鳅为研究对象，在25对选择性扩增引物组合中选出6对引物，对比分析甲基化水平及模式发现，父本、母本及其F1代的CCGG位点中，总甲基化率分别是38.27%，24.21%及27.21%。分析这些位点的甲基化模式表明：杂交过程中甲基化模式进行了大量的调整，包括单态性位点（A型），480个（29.0%）；去甲基化类型（B型），285个I摘要（17.2%）；过或超甲基化类型（C型），628个（37.9%）；次甲基化类型（D型），263个（15.9%

6、）。研究表明，在杂交过程中，子代的甲基化水平介于双亲之间，子代存在的特异模式所占比例较低，从亲本到子代的传递过程主要以过或超甲基化为主。综上所述，在泥鳅多倍化与杂交的过程中发生了一定程度的基因组DNA甲基化水平及模式的改变，本文从分子生物学的角度进行系统研究，旨在探索多倍化及杂交过程的表观遗传机理，为我国泥鳅产业的育种提供了科学依据，同时为我国泥鳅的产业化探索高效益的新途径奠定基础。关键字：泥鳅；二倍体；三倍体；四倍体；DNA甲基化；MSAPIIAbstractAbstractInordertoinvestigatethegenomicDNAmethylat

7、ionlevelsandpatternsofdifferentploidyandparent-offspringloacheswhichanalysistheirepigeneticdifferences.Inthisresearch,weselectednaturaldiploid,naturaltriploidandnaturaltetraploidandhybridizedtriploid(4n♀×2n♂)assubjects.WeusedorthogonalexperimenttoestablishedthebestsystemsforMSAPand

8、usedthismethodtoanalysisge