药物长期毒性试验中不同给药周期试验浅析

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实用标准文案审评二部黄芳华长期毒性试验是药物非临床安全性评价的核心内容，通过重复给药的动物试验表征受试物的毒性作用，预测其可能对人体产生的不良反应，降低临床受试者和药品上市后使用人群的用药风险。针对长期毒性试验，《中药、天然药物长期毒性试验技术指导原则》和《化学药物长期毒性试验技术指导原则》均在国内首次提出了“可以用不同给药期限的长期毒性试验来分别支持Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期临床试验”，即对于一些临床疗程较长的药物，药品注册申请人可以根据药物开发的实际情况，选择在Ⅰ期临床前、Ⅱ期临床前或Ⅲ期临床前分别报送支持不同阶段临床研究的长期毒性试验资料。在该指导原则发布后，有些注册申请人已开始接受该种方式，并进行了分阶段提交长期毒性试验资料。但是有些申请者未能全面理解甚至是误解了该不同给药周期长期毒性试验的具体涵义，导致虽采用了此种方式而未能充分体现出此种方式的优越性，尤其是在中药新药的申请过程中。现根据国际上对长期毒性试验的要求，对分阶段要求及不同给药周期长期毒性试验进行浅析。以下仅属个人观点，有不同意见欢迎交流。一、长期毒性试验的名称和所包含内容首先，需明确一下“长期毒性试验”这一名称，通常所指长期毒性试验，包含了不同给药周期的试验，事实上“长期毒性试验”该名称仅限于国内使用，在撰写指导原则的过程中，因为考虑到目前国内的实际使用情况和习惯，而沿用了该名词。国际上将此类试验统称为重复给药毒性试验（Repeatdosetoxicitystudies），区别于急性毒性试验（Acutetoxicitystudy），是观察动物重复给药后的影响，来预测受试物对人体是否有潜在的影响。重复给药毒性试验包含了不同给药周期的试验，1-4周为短期毒性试验（short-termtoxicitystudies），3个月为亚慢性毒性试验（subchronictoxicitystudies），6-12个月为慢性毒性试验（chronictoxicitystudies）。二、关于分阶段要求及来源文档 实用标准文案中药和化学药物指导原则中均明确了长期毒性试验的给药期限及以不同周期的长毒试验支持不同阶段的临床研究阶段，中药和化学药物的要求是一致的，具体如表1。表1长期毒性试验的给药期限short-termtoxicitystudies）、亚慢性毒性试验（subchronictoxicitystudies）、慢性毒性试验（chronictoxicitystudies）。其中慢性毒性试验有所区别，常规的慢性毒性试验给药周期为6-12月，但不同国家对此周期并不完全一致，ICH三方于根据对上述非啮齿类动物试验资料的全面分析和评估,以及ICH-1在啮齿类动物试验要求方面已达成的共识，为避免重复试验，并使协调三方在新药慢性毒性试验方面有可遵循的统一要求，ICH三方于1998年认为可接受以下慢性毒性试验资料：给药周期为6个月的啮齿类动物试验研究和给药周期为9个月的非啮齿类动物试验。参考ICH指导原则，我们将长毒试验的最长周期定为啮齿类动物6个月和非啮齿类动物9个月。长期毒性试验分阶段要求的提出，有其科学背景，因为此种做法更加符合药物研发的科学规律。①一些给药期限较长的长期毒性试验，例如9个月的长期毒性试验，周期长、耗材多，成本昂贵，试验设计上的失误往往会造成时间和资金的巨大浪费。而通过1个月或3个月的长期毒性试验获得的信息，可以为较长给药期限的长期毒性试验的给药剂量、给药频率等设计提供重要的参考，降低一次性进行较长给药期限长期毒性试验的风险。②药物通过较短期限的长期毒性试验进入临床试验后，获得的人体安全性信息有助于判断动物和人体之间的相关性，使给药期限较长的长期毒性试验的试验指标的设计更具针对性。国际上已通用此种分阶段方法以支持不同的临床研究阶段，如ICH的M3指导原则《支持药物进行临床试验的非临床安全性研究》（1997年）已明确指出不同给药周期的重复给药毒性试验用于支持不同周期的临床试验。在这种情况下，考虑到新药研究的逐步进行、层层推进的客观规律，我们参考国际上的要求，提出了分阶段的概念。此外，由于国内长期的习惯，我们仍保留了一次性进行支持其进入Ⅲ文档 实用标准文案期临床试验（及生产）的长期毒性试验的方式。这种方式相对于分阶段需进行多个不同给药周期的长期毒性试验的方式，若是设计合理仅进行一个长周期的试验就能得到充分的信息进而可支持进行各期临床研究，则能节省一些成本。如对于某些对于安全性有较大把握的中药，一次性的方式仍不失为一种可取的方式。但是与分阶段试验方式相比，这种方式存在较大的风险性。应注意的是以不同给药期限的长期毒性试验来分别支持药物进入I期、II期或Ⅲ期临床试验，不同给药期限的长期毒性试验的内容均不应简化。它并不意味着可以用长期毒性试验的中期报告来支持临床试验，每期长期毒性试验的内容应完整、规范，对结果的分析评价应科学、合理。若片面理解此种分阶段方法，有些研究者可能设计一个样本量较大的长毒试验，在1个月、3个月、6个月或9个月时分别处死动物，检测指标，同时设立各个时间点的恢复期，这样就可以在第一时间内完成给药期限较长的长期毒性试验，但这种试验设计并没有充分体现出前文所述的科学性，无法达到预期的目的，因此属于不符合要求的分阶段方法。我们鼓励创新性药物在进行长期毒性试验设计时应积极考虑采用“不同给药期限的长期毒性试验来分别支持Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期临床试验”，因为对于一个全新的药物，可参考的信息少，通过分阶段的方法可逐步了解药物的毒性，为下一步试验设计提供更充分的信息，可有效地规避风险，提高试验的成功率。此外，还可在逐步进行试验过程中，根据毒性试验结果和临床研究结果等综合考虑，淘汰开发价值不大的候选药物。三、不同给药周期的重复给药毒性试验的要求介绍在新药研究过程科学、合理地应用分阶段的方法，其关键在于理解其药物研发的客观规律、分阶段的科学内涵、各不同给药周期试验的特点。各不同给药周期试验在药物研发阶段所处的时间不同，目的不同，因此试验设计有所区别，如关注重点不同，监测指标不同，预测的毒性反应也不同。绝不能简单地理解为设计好一个试验方案，将同样的方法用于不同给药周期的重复给药试验，在不同的时间提交以支持不同的临床研究阶段，这样完全达不到分阶段的目的，也是一种资源的浪费。文档 实用标准文案分析目前各国对重复给药毒性试验的要求，具体试验要求并不完全一致，主要从总体原则上予以把握。如FDA对药品的重复给药毒性试验未提出具体的要求，执行ICH的基本要求。EMEA于2000年制定了重复给药毒性指导原则（NoteforGuidanceforRepeatedDoseToxicity.），该指导原则主要针对重复给药毒性试验的总体要求，而无对各不同周期试验的具体要求。与之相比，OECD则出台了具体的试验指导原则如急性毒性试验指导原则、口服给药28天啮齿类动物重复毒性指导原则（1995）、口服给药90天啮齿类动物重复毒性指导原则（1998）、口服给药90天非啮齿类动物重复毒性指导原则（1998），相对来说比较全面。此外，FDA针对食品成分（foodingredients）提出了一系列安全性指导原则，其中包含了短期、亚慢性、慢性长毒指导原则（2003）。美国的EPA也提出了慢性毒性试验指导原则（healtheffectstestOPPTS870.4100chronicToxicity）。针对目前国内对各不同给药周期的重复给药毒性试验不甚了解、未进行过深入研究的情况，现简要分析国际上对此类问题的看法，虽然目前国际上对重复给药毒性试验尚无统一的具体试验要求，但是了解这些要求将有助于对不同周期毒性试验有进一步了解。（一）《PrinciplesandMethodsofToxicology》（TheFourthEdition，2001）一书中对重复给药毒性试验的描述在该书的Short-Term,Subchronic,andChronicToxicologyStudies章节，指出不同周期试验监测指标不同，因此预测的毒性反应也不同。急性毒性试验、短期毒性试验、亚慢性毒性试验、慢性毒性试验是顺次进行的，前一试验为后一试验设计提供信息，如急性毒性研究结果可用于估计短期毒性研究试验的剂量及获得最初的资料以有助于评价相关毒性，从短期毒性研究获得的信息需用于亚慢性毒性试验设计，同样，亚慢性毒性试验资料对于慢性毒性试验设计也是必需的。从短期毒性研究至更长期的毒性研究的进展中最主要的用处是，尽可能最大限度地保证可选择合适的剂量范围。该章节中，明确指出了短期重复给药毒性试验、亚慢性毒性试验的目的，详见表2、3。表2：短期重复给药毒性试验的目的文档 实用标准文案表3：亚慢性毒性研究的目的短期毒性试验所获得的一些信息（如受试原料/食物混合物的味道、体重反应情况、体态观察、能观察到的行为变化、临床病理学、肉眼尸检、组织病理学检查、确定毒性靶器官、剂量反应关系）对于后继研究设计中有用，其中对毒性评价指标的剂量反应关系是后继研究是否成功的关键，此外，遗传毒性试验和药代资料是短期毒性试验的补充。在一些情况下，亚慢性毒性研究可能已完成对危险性评价所需资料的要求，因它已足以预测化合物的长期应用、低剂量暴露的危险性。另一些情况下，亚慢性毒性研究有助于设计其他附加研究设计（包括慢性毒性研究），也有助于致癌性试验和生殖毒性试验。另外，特别对短期毒性试验的几个问题进行了明确，首先是给药周期，短期毒性试验通常是14或28天试验，28天的研究比14的研究能提供更多有用的信息。其次，剂量选择取决于研究目的，如该试验是为亚慢性毒性试验提供信息，通常可设计更高的剂量检测毒性靶器官，相对而言确定NOAEL则不重要，但是预计无进一步的研究，则包含NOAEL的剂量范围则变得更重要。第三，短期毒性试验与亚慢性毒性试验的每组动物数要求不同，后者比前者多。该章节中还指出：原各国对重复给药毒性试验要求不一致。为达到统一要求，采用一个试验满足各国要求，世界各管理当局努力协调各国的指导原则使之进行一个试验能在世界范围内接受。如OECD和ICH出台了一些指导。ICH指导原则通常考虑毒性试验的特殊方面，如慢性毒性试验，而不是对于方案设计的详细指导原则。但是，一个好的计划、科学有效、充分控制的重复毒性试验可满足各国管理当局的要求。（二）OECD指导原则文档 实用标准文案OECD对重复给药毒性试验制定了一系列指导原则，包括：口服给药28天啮齿类动物重复给药毒性指导原则（1995）、口服给药90天啮齿类动物重复给药毒性指导原则（1998）、口服给药90天非啮齿类动物重复给药毒性指导原则（1998）等。从以上指导原则比较看，各期试验有其共同点，也有其不同点，比较如下（见表4、表5）：表4各不同给药周期的毒性试验的相同点（OECD）表5各不同给药周期的毒性试验的相同点（OECD）（三）FDA对食品成分的要求FDA的OfficeofFoodAdditiveSafety在其Redbook2000ToxicologicalPrinciplesfortheSafetyofFoodIngredients（November2003）收录了以下有关重复给药毒性试验内容：lShort-TermToxicityStudieswithRodentslShort-TermToxicityStudieswithNon-RodentslSubchronicToxicityStudieswithRodentslSubchronicToxicityStudieswithNon-RodentslOne-YearToxicityStudieswithNon-Rodents以上对食品成分的要求不针对药品，不能直接套用于药品，但是从其不同的要求也可初步看出不同的试验之间的关联性和不同点，有助于加深了解。因此，对各试验间的相同点及不同点总结如下（表6、表7）：表6各不同给药周期的毒性试验的相同点（FDA，OfficeofFoodAdditiveSafety）表7各不同给药周期的毒性试验的不同点文档 实用标准文案（FDA，OfficeofFoodAdditiveSafety）（四）对分阶段试验的总结和思考通过以上指导原则及相关文献分析，我们可认识到各国对重复给药毒性试验并无统一要求，各不同给药周期试验有其共同及不同点。但是综合分析，有其共同点，总结如下：（1）最终目的一致，即通过一系列试验来预测药物重复给药后潜在的毒性，预测对人的风险；（2）不同试验有不同的目的，因此不同给药周期试验的试验方法不尽一致，但总体而言随着周期增长达到逐渐递进的目的，更短周期的试验为后续更长周期的试验设计提供信息；（3）试验设计的基础是科学性，需根据具体情况进行具体设计，在遵循基本原则的基础上，综合各方面信息进行合理的设计。试验并无统一的格式可遵循，只要是科学、合理的设计及试验即可接受。（4）试验进行需科学、规范，需有良好的质量控制，并需对结果进行客观分析，将毒性试验信息与其他各方面信息进行整合，对安全性进行综合分析和评价。随着国内新药开发的水平逐渐提高，我们欣喜地看到研究的意识也正日益提高，在新药研发过程中进行分阶段的重复毒性试验也逐渐被研究者接受，但是仍存在一些问题。针对这种情况，提出以下思考：1、应遵循药物研制开发的客观规律，科学、合理地应用分阶段的毒理试验方法，促进药物研发的进程。药物研发是一个渐进的过程，进行分阶段的重复给药毒性试验，是促进药物开发顺利向前的重要保证。正因为国际上对重复给药毒性试验无统一要求，如何设计并进行合理的试验需靠各试验者的努力。以上国外的指导原则因发布时间较早或不针对药品，因此最重要的价值在于了解其中的科学原理，而不能简单、机械地全盘照搬，不可能有一下现成的格式可以参考。作为研究者，应理解分阶段试验的内涵，把握各期重复给药毒性试验，进行合理的设计、良好的质量控制、全面的综合评价。2、试验设计时应综合考虑多方面因素，如化合物的背景资料、相关化合物的情况、前期毒性研究结果、预期的后继试验、其他研究结果等等，对于中药，还应结合临床应用背景情况。试验设计应科学、合理，观察指标应仔细，发现有异常毒性时应予以追踪。文档 实用标准文案3、作为研究者，应主动加强探索，加强研究意识，加强药物安全性评价，提高药物研究水平。虽然分阶段进行重复给药试验在我国尚处于起步阶段，但是我们应看到进步的潜力。我们鼓励在药物研发过程中采用分阶段的毒性试验方式，尤其是创新药。但是不能否认的是，国内的毒理评价水平尚待提高。而且，对事物的认识总是在发展中不断前进，药物研究的认识和水平也在日渐提高。因此作为研究者，应主动进行探索，加强研究意识，跟踪学科领域的最新进展，从科学、规范的角度出发进行药物安全性评价，以提高药物研究水平。以上仅属个人观点，不妥之处欢迎交流。参考文献1、《中药、天然药物长期毒性试验技术指导原则》20052、《化学药物长期毒性试验技术指导原则》20053、ICH/M3,Non-clinicalsafetystudiesfortheconductofhumantrialsforpharmaceuticals.1997.4、ICH/S4,Durationofchronictoxicitytestinginanimals(rodentandnon-rodenttoxicitytesting).1998.5、EMEA，NoteforGuidanceforRepeatedDoseToxicity.2000.6、NelsonH.Wilson,JerryF.Hardisty,etal.Short-Term,Subchronic,andChronicToxicologyStudies.A.WallaceHays.PrinciplesandMethodsofToxicology.TheFourthEdition.Philadelphia:Taylor&Francis,2001.917~957.7、ICHS4，DurationofChronicToxicityTestinginAnimals(RodentandNonRodentToxicityTesting)8、ICHM3，MaintenanceoftheICHGuidelineonNon-ClinicalSafetyStudiesfortheConductofHumanClinicalTrialsforPharmaceuticals文档 实用标准文案9、FDA，Redbook2000ToxicologicalPrinciplesfortheSafetyofFoodIngredients（November2003）10、OECDGuidelinefortheTestingofChemicals，RepeatedDose28-dayOralToxicityStudyinRodents，199511、OECDGuidelinefortheTestingofChemicals，RepeatedDose90-dayOralToxicityStudyinRodents，199812、OECDGuidelinefortheTestingofChemicals，RepeatedDose90-dayOralToxicityStudyinNon-Rodents，1998文档