重组维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaa对鲤tlr5m信号通路的调节

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1、中文摘要重组维氏气单胞菌鞭毛蛋白FlaA对鲤TLR5M信号通路的调节鲤鱼是我国淡水养殖的主要品种，在水产养殖业中占重要地位。随着养殖规模和养殖密度的不断扩大，病害问题日益严重，由细菌引起的疾病严重制约淡水养殖业的健康发展。维氏气单胞菌（Aeromonasveronii）是水生环境中普遍存在的一种致病菌，是引起鱼类败血症、鱼体溃疡综合征的主要致病菌，同时该菌还能引起人的感染而发生腹泻或食物中毒，严重威胁养殖业的健康发展以及公共卫生安全。维氏气单胞菌的致病性与其产生的多种毒力因子息息相关。脂多糖、肠毒素、外膜蛋白和S层蛋白作为重要的毒力因子国外已深入

2、研究。鞭毛作为细菌重要的运动器官，在与其他微生物的竞争中发挥重要作用，然而鞭毛在细菌粘附、生物被膜形成以及几种病原菌定植中同样起关键作用。鞭毛作为细菌重要的毒力因子，能有效激活天然免疫应答。鞭毛蛋白作为细菌鞭毛的主要组成部分，是TLR5的配体，能与细胞表面的TLR5结合，通过MyD88（髓样分化因子88）依赖途径，迅速募集IRAKs(IL-1受体相关激酶)，并结合TRAF6(TNF受体相关因子6)，进而激活细胞核转录因子NF-κB、诱导TNF-ɑ，IL-1β等前炎症细胞因子的产生，从而介导机体对抗入侵异源病原体。本研究从肝脏肿大的病死鲤鱼中分离细

3、菌CCA1301，采用生理生化方法、药敏实验抗菌分析，结合16SrDNA序列比对分析，鉴定该菌为维氏气单胞菌。采用透射电镜观察菌体及鞭毛形态，并利用酸解法和离子交换层析法获得高纯度的天然鞭毛蛋白，为后续实验操作奠定基础。而后，根据GeneBank中公布的气单胞菌基因序列，MegAlign进行多序列比对，在基因保守区设计特异性引物，成功克隆flaA基因，序列长度为915bp。将连入目的基因的pMD-18T克隆载体和原核表达载体pET-30a，进行质粒双酶切，成功构建重组表达载体pET-30a-flaA。将构建好的表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3

4、）进行诱导表达，得到大小约为38kDa带有His-tag的目的蛋白。采用镍离子亲和层析法纯化蛋白，随后免疫新西兰大白兔，获得鞭毛蛋白FlaA抗血清。Westernblot实验证实FlaA抗血清不但能与重组鞭毛蛋白发生反应，而且也能与天然鞭毛蛋白发生反应，证明重组鞭毛蛋白FlaA具有较强的免疫原性，为进一步研究鞭毛蛋白的抗原性及免疫佐剂作用奠定基础。最后，分别用维氏气单胞菌、纯化的天然鞭毛蛋白和重组鞭毛蛋白FlaA刺激鲤鱼，分别经12h和4h后，提取头肾总RNA。利用荧光定量PCR方法分析III鲤鱼头肾TLR5M及其信号通路中TRAF6、TNF-α

5、表达量的差异情况。荧光定量PCR结果表明，与细菌、天然鞭毛蛋白刺激组相比，重组鞭毛蛋白FlaA同样能使头肾中TLR5M、TRAF6、TNF-α的表达量升高，说明重组鞭毛蛋白FlaA能够调节鲤鱼TLR5M及其信号通路中的相关因子，进而产生免疫应答反应。关键词：维氏气单胞菌；鞭毛蛋白；TLR5M；调节IVAbstractRecombinantAeromonasveroniiFlagellinFlaAMediateToll-likeReceptor5MSignalingPathwayofCommoncarpCommoncarpisthedominant

6、speciesoffreshwateraquacultureinourcountryandoccupiesanimportantpositionintheaquacultureindustry.Withthegrowingscaleoffarmingandbreedingdensity,BacterialInfectionshasbecomeanobviousobstaclerestrictingthedevelopmentofaquaculture.Aeromonasveronii,aubiquitouspathogenintheaquatic

7、environment,cancausesepticemiaandulcerativesyndromeoffreshwaterfishesandcausehumandiarrheaorfoodpoisoningafterinfection.Thispathogenposesaseriousthreattofishfarmingandhumanhealth.Aeromonasveroniicanproduceavarietyofpathogenicvirulencefactors,suchaslipopolysaccharide,enterotox

8、in,outermembraneproteinandS-layerprotein,whichhaveindepthstudyabroad