转bphc苜蓿—乳化蛋白alna联合修复多氯联苯污染土壤研究

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1、转bphC苜蓿-乳化蛋白AlnA联合修复多氯联苯污染土壤研究ThephytoremediationofalfalfasexpressingbphCforPCBscontaminatedsoilsinthepresentofAlnA作者姓名：王岩专业名称：环境工程研究方向：环境生物技术指导教师：张兰英教授任何军副教授学位类别：工学博士培养单位：吉林大学环境与资源学院论文答辩日期：2015年6月3日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位：姓名职称工作单位：林山杉教授东北师范大学主席霍明昕教授东北师范大学环境学院冯传平教授中国地质大学（北

2、京）委员韩相奎教授吉林建筑大学市政与环境工程学院于洪文研究员中国科学院东北地理赵勇胜教授吉林大学环境与资源学院与农业生态研究所盲审教授董军教授吉林大学环境与资源学院盲审教授刘娜教授吉林大学环境与资源学院摘要转bphC苜蓿-乳化蛋白AlnA联合修复多氯联苯污染土壤研究多氯联苯（PolychlorinatedBiphenyls，PCBs）是一类人工合成的环境异源物质，由于其在环境中难降解性及具有生物富集性，已被《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》列为12种持久性有机污染物（PersistentOrganicPollutants，POPs）之一。PCBs虽已被

3、禁止生产，但已造成“全球性的环境污染”。PCBs的植物修复技术，具有低成本、应用性强、对环境友好、可最大程度保持土壤基本性质不变等特点，是最具有应用前景的修复技术。但是植物修复技术受PCBs对植物生长毒害作用及土壤中PCBs生物可利用性低等因素的限制，在实际场地修复中，效果往往达不到预期。因此，本研究拟利用转bphC苜蓿联合乳化蛋白AlnA修复PCBs污染的土壤，研究转基因苜蓿对PCBs的耐受性；分析AlnA能否提高PCBs的生物可利用性；阐明转基因苜蓿-乳化蛋白AlnA联合修复PCBs污染的土壤效能。（1）亚克隆来源于土壤宏基因组的2,3-二羟基联苯双加氧

4、酶基因（bphC），构建其植物表达载体。利用农杆菌介导的方法，遗传转化于苜蓿，通过草胺膦的抗性筛选，获得了10株苜蓿转化株系。并采用无性繁殖的方法进行扩繁，用于后续转基因株系的鉴定研究。通过PCR方法和westernblot等分子生物技术检测苜蓿转化株系，结果表明bphC基因已经整合进入6株转基因苜蓿株系，并在植株体内表达。（2）通过对联苯的抗性筛选、转基因苜蓿体内bphC酶活检测，确定转基因苜蓿株系BB11对PCBs的耐受性最强。采用水培法，研究转基因苜蓿对混合PCBs的耐受性，结果表明转bphC苜蓿对混合PCBs的耐受指数为88%，与野生型苜蓿（仅为54

5、%）相比，提高了34%。通过比较分析转基因和野生型苜蓿体内PCBs含量研究发现：转基因苜蓿和野生型苜蓿都能吸收和输导PCBs，但是转基因苜蓿体内PCBs含量显著低于野生型苜蓿，说明转基因苜蓿对PCBs降解效率显著高于野生型苜蓿。因此，在后续的实验中以转bphC苜蓿BB11作为实验材料。（3）从抗辐射不动杆菌（Acinetobacterradioresistens）中克隆AlnA基因，构建原核表达载体，在IPTG诱导下，AlnA蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达，通过镍柱纯化和westernblot奠定，获得纯化的AlnA蛋白。AlnA蛋白具有表面I活性，CMC值

6、为1.07g/L(≈0.03mM)。AlnA蛋白对不同氯原子数取代PCBs同系物都具有增溶活性，其中对四氯代的PCB52增溶活性最强。乳化蛋白AlnA虽能吸附于土壤，但是对土壤中的PCBs具有较强的解吸能力，其解吸能力与氯原子的取代数目没有相关性，对四氯代PCB52的解吸效率达74%。并且AlnA蛋白能促进苜蓿吸收土壤中的PCBs，AlnA蛋白的添加量与植物组织中PCBs的浓度成正相关。苜蓿不仅能吸收PCBs，也能将PCBs运送到地上部分，其中PCB28在苜蓿地上部分的浓度最高，说明苜蓿对其运输能力最强。通过3D建模和分子拼接的方法，研究AlnA蛋白对PCB

7、同系物的增溶机制。根据分子对接和溶解活性研究结果分析，AlnA蛋白对PCBs的溶解机制与结合能，结合簇及能量构象密切相关。AlnA蛋白为非特异性的生物表面活性剂，PCBs可与AlnA蛋白不同结合位点结合，形成多重构象。利用盲目对接手册研究表明：高氯代的PCBs（PCB28,52和101）与AlnA蛋白有较强的亲和力。7种PCBs同系物都与AlnA蛋白具有典型的β-桶状结构结合。不同的PCB同系物与AlnA蛋白之间存在着不同的结合位点，这也受到PCBs分子的空间位阻和电子云分布的影响。（4）利用盆栽实验，研究转bphC基因苜蓿联合乳化蛋白AlnA对PCBs污染

8、土壤的修复效能。实验结果表明，转bphC基因苜蓿-乳