胎衣不下奶牛母体胎盘组织差异表达microrna的筛选及验证

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1、Universitycode：10223Classifiedcode：S857.2Graduatenumber：XS1233085Confidentialdegree：publicHeilongjiangBayiAgriculturalUniversityMasterDissertationFilterandverifydifferentialexpresseionofMicroRNAsinthematernalplacentaofcattlewithretainedfoetalmembranesPostgraduate：

2、ChengyuanZhengSupervisor：ShixinFuProfessorMajor：ClinicalVeterinaryMedicineResearchdirection：ReproductiveObstacleDiseaseCollegeofAnimalScienceandCollege：VeterinaryMedicineDaqingChinaJune,2015摘要本实验主要目的是采用Solexa高通量测序技术和生物信息学分析方法，构建sRNA文库和分析奶牛胎衣不下和胎衣正常排出时母体胎盘组织间差异表达的m

3、icroRNAs（miRNAs），影响该病发生发展的关键miRNAs，并对部分miRNA进行验证，以期从分子层面揭示该病的发病机制、为临床防治效果提供理论依据。实验方法：选取年龄、胎次、泌乳量、体重都相近，且无其它疾病影响的胎衣正常排出奶牛母体胎盘（normalmaternalplacenta，NC）作为对照组，胎衣不下奶牛母体胎盘（retainedmaternalplacenta，RC）作为实验组，每组三头奶牛。采用Trizol裂解法提取组织总RNA，构建NC和RC的cDNA文库，并采用Solexa高通量测序方法对文库进

4、行测序，筛选两文库中差异表达的miRNAs。随机挑选8个差异表达的miRNAs，应用实时荧光定量PCR的方法对测序结果进行验证。利用生物信息学软件预测差异表达miRNAs的靶基因，最后进行GO富集分析和KEGGPathway通路分析。实验结果：成功构建了小RNA文库，高通量测序在NC和RC文库中获得的高质量序列分别为5962381与5446898条，两个文库中高质量序列占原始小RNA序列比率均在99%以上（99.37%，99.43%），两个文库中sRNA大小主要集中在19nt-24nt，22nt大小的片断是两个文库中最多的

5、，NC和RC文库分别占据53.76%和56.21%；69个已知miRNAs在奶牛胎衣正常排出组和胎衣不下组母体胎盘组织中差异显著表达，与胎衣正常排出组母体胎盘相比，其中36个显著下调，33个显著上调（P＜0.05）；在NC和RC文库中分别发现36种和33种新miRNA候选者；实时荧光定量PCR验证与测序结果一致，实验组与对照组相比bta-miR-423-5p，bta-miR-181a，bta-miR-185显著下调（P＜0.05）；bta-miR-411a，bta-miR-31，bta-miR-424-5p显著上调（P＜0

6、.05）；bta-miR-1839和bta-miR-1上调但不显著（P＞0.05）；对差异表达的miRNAsGO分析结果显示，与蛋白结合，杂环化合物结合，金属离子集合和催化活性等功能相关基因出现频率最高，但无显著富集（P＞0.05）；KEGGPathway分析结果显示，癌症通路，肌动蛋白细胞骨架调节通路和MAPK信号通路被显著富集（P＜0.05）。实验结果说明奶牛在发生胎衣不下时，母体胎盘中部分miRNA的表达发生明显变化，这些表达变化miRNA可通过调节相关基因的表达，特别是与细胞粘附作用和肌肉收缩作用相关蛋白mRNA的

7、表达，通过复杂的调控网络，在一定程度上影响胎衣不下的发生。关键词：胎衣不下，奶牛，miRNA，母体胎盘，差异表达IAbstractThemainpurposeofthestudywastoscreenandidentifydifferentialexpressionmiRNAsinthematernalplacentaofHolsteincattlewithretainedfoetalmembranesbytheSolexasequencingandtheBioinformaticsanalysismethod,andse

8、archingthekeyofmiRNAswhichinfluencethedevelopmentofdisease.ForProvidingascientificbasisofthediseasepathogenesis,andtorevealthepathogenesisofdisease,topr