猪圆环病毒2型与猪鼻支原体共感染协同致病性研究

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1、密级:论文编号:中囯农业科学院学位论文猪圆环病毒2型与猪鼻支原体共感染协同致病性研究StudiesonSynergeticPathogenicityofCo-infectionwithPorcineCircovirusType2andMycoplasmahyorhinis硕士研宄生：陈冬杰指导教师：刘长明研宄员申请学位类别：农学硕士专业：彌腾E学研宄方向：善固培养单位：哈尔滨兽医研宄所研宄生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationStudieson

2、SynergeticPathogenicityofCo-infectionwithPorcineCircovirusType2andMycoplasmahyorhinisM.S.Candidate:ChenDongjieSupervisor:Prof.LiuChangmingMajor:PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:VeterinaryMicrobiologyandMolecularBiologyMay2015III摘要猪圆环病毒2型（Porcinecircovirus2，PCV2）是引起猪圆环

3、病毒相关疾病（Porcinecircovirus-associateddisease，PCVAD）的重要病原，对我国养猪业造成了巨大的经济损失。猪鼻支原体（Mycoplasmahyorhinis，Mhr）能够感染不同年龄的猪，引起胸膜炎、腹膜炎、关节炎、中耳炎、多发性浆膜炎及猪地方性肺炎（Swineenzooticpneumoniae，SEP），严重影响猪只生长性能。该病原体在临床上常与PCV2、PRRSV等病原体混合感染，致使断奶仔猪的死亡率显著升高。目前Mhr和PCV2的共感染特性及其感染机制尚不清楚，阐明这两种病原体协同感染对仔猪的致

4、病性具有重要的临床意义。本研究通过建立Mhr核酸、抗原和抗体等的检测方法，利用实验室分离的Mhr（DL株）与PCV2（PCV2b，YJ株）进行了共感染试验，旨在阐明这两种病原体共感染对仔猪的致病性作用。第一、猪鼻支原体抗体间接ELISA检测方法的建立及应用。为了检测猪血清中Mhr抗体水平，本研究采用脱氧胆酸钠法（DOC）提取Mhr膜蛋白作为包被抗原，建立了用于Mhr血清抗体检测的间接ELISA方法。其特异性为90.5%，敏感性为98.0%。除猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhyo）外，该方法与几种猪病毒阳性血

5、清及副猪嗜血杆菌IV型阳性参考血清均无交叉反应。对Mhr-DL菌株感染巴马猪血清抗体检测表明，Mhr感染后第3d血清抗体阳转，第35d时抗体达到高峰，抗体效价为1:6400。用该方法与IDEXX肺炎支原体抗体检测试剂盒平行检测138份现地血清样品，Mhr和Mhp阳性检出率分别为71.0%和44.9%。对来自黑龙江、吉林、山东等地临床送检的457份血清检测结果显示，Mhr阳性率为70.3%，表明我国养猪群Mhr感染十分普遍。第二、抗Mhr膜蛋白的单克隆抗体制备及抗原表位的鉴定。本研究以DOC提取的Mhr膜蛋白免疫BALB/c小鼠，并通过淋巴细

6、胞杂交瘤技术获得了10株能够稳定分泌特异性抗DOC提取膜蛋白的杂交瘤细胞株，依次命名为1B4、1D2、1H8、1H12、2B6、2H2、3G2、3G10、4B7和4H2；MAb亚类鉴定除2H2为IgG2b亚型外均为IgG1亚型，轻链均为κ链；杂交瘤细胞培养液55上清效价为1:200～1:400，腹水效价为1:1.0×10～1:2.0×10；Westernblot结果显示，其中5株单克隆抗体针对Mhr同一种大小膜蛋白产生特异性反应。经质谱分析、蛋白表达和Westernblot鉴定该膜蛋白为Mhr丙酮酸脱氢酶E1复合体α亚基。为了对其抗原表位进

7、行鉴定，通过对Mhr丙酮酸脱氢酶E1复合体α亚基截短表达与人工合成肽相结合的方法对其表位进一步分析，初步269283299313确定了3个抗原表位，分别为SSDNPRIYRTEEEEK，KDKKYITDEEIKQIW和350360LKEQKQHAKDY。第三、Mhr核酸检测SYBR荧光定量PCR方法的建立及其应用。为了检测猪血液及组织中Mhr核酸载量，本研究参考GenBank发表的MhrP37基因序列设计一对特异性引物，建立了一种能够检测Mhr核酸载量的特异性好、敏感性高的SYBR荧光定量PCR方法。该方法扩增效率为1.04，误差值为0.0

8、189，批内变异系数小于2.0%。与常规PCR相比，本方法敏感性提高100倍以上。该方法与猪圆环病毒1型（PCV1）、PCV2、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬